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作者：李林作者单位：齐齐哈尔医学院组胚教研室
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' | u) Q) P$ r( F 【摘要】 目的 本实验旨在建立一种体外分离培养、纯化扩增人骨髓间充质干细胞（MSCs）的方法。方法 比较单纯的贴壁培养法与密度梯度离心法（采用淋巴细胞分离液）结合贴壁培养法分离纯化成年人MSCs。结果 成年人MSCs呈均一的成纤维细胞样，不表达造血谱系抗原CD14、CD34、CD45。结论 利用密度梯度离心法（采用淋巴细胞分离液）结合贴壁培养法能有效分离纯化成年人MSCs，用此种方法培养的细胞具有MSCs的一般生物学特性。 8 G; d# J% A$ l, u" L. g& Z9 E6 D! h
【关键词】人骨髓间充质干细胞 分离 淋巴细胞分离液
) z' @; j5 J! A0 P \& ] 自发现骨髓间充质干细胞的存在并建立骨髓间充质干细胞分离培养的方法以来，有关MSCs的研究正逐渐深入。MSCs能在特定条件下可诱导分化为成骨细胞，脂肪细胞，成软骨细胞，成肌细胞，成心肌细胞及神经细胞等细胞类型外。由于具有体外易纯化、培养、操作等特点，MSCs是理想的组织工程启动细胞和基因治疗靶细胞。本实验采用了一系列分离和纯化方法分离培养人MSCs，并检测了人MSCs的生物学特性以鉴定所获得的MSCs。) \; Q+ g, ?% O5 Y
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1材料与方法' G* h* V3 l% y6 \
9 X* I" C& t7 D: a) |0 W 1.1实验材料
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1.1.1主要仪器MILLI-Q超纯水纯化系统 （法国），OLYMPUS IX70 倒置相差显微镜（日本光学工业株式公社），MCO-17AICO2培养箱（日本SANYO公司），哈东联净化工作台（苏州安泰空气技术公司），BECKMAN Allegr 21R 恒温离心机 （德国）。
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. F0 w5 Y; W( W 1.1.2主要试剂LG-DMEM培养液（Hyclone公司），优质胎牛血清(FBS，Hyclone公司)，Trypsin（sigma公司），地塞米松干粉（sigma，培养纯），维生素C干粉（sigma，培养纯），胰岛素（sigma 公司），淋巴细胞分离液（1.077g/ml，TBD公司），Rabbit Anti-Collagen TypeⅡ(博士德生物工程有限公司)，羊抗兔IgG （二抗）(博士德生物工程有限公司)，SDAB试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。
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1.2方法( R; K- F) w4 i2 k) \
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1.2.1单纯贴壁筛选法取新鲜人（46岁女性）骨髓加入肝素抗凝，分成3组，1组直接把骨髓与培养液1∶3混合接种于25cm2培养瓶中；2组直接把骨髓与培养液1∶9混合接种于25cm2培养瓶中；3组直接把骨髓加入3~4ml的PBS以1000转/min离心，洗两次后，加入培养液5ml接种于25cm2培养瓶中；细胞贴壁生长，每次换液弃除悬浮生长的造血细胞。
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# l' `; o1 w% l' i! Y 1.2.2密度梯度离心法结合贴壁筛选法取新鲜人（44岁女性）骨髓加入肝素抗凝，首先我们通过用淋巴细胞分离液（1.077g/ml）梯度离心法，分出处于1.077g/ml密度界面上的单个核细胞，将单个核细胞细胞接种于培养瓶，细胞贴壁生长，每次换液弃除悬浮生长的造血细胞。贴壁细胞主要是MSCs，但可能混有巨噬细胞等，每次传代用0.25%胰蛋白酶消化，严格控制酶的量和消化时间，利用MSCs较易脱落的特点，保证MSCs在短暂的作用时间内与培养瓶底分开，巨噬细胞等则因贴壁性强仍贴附于培养瓶底，从而使MSCs得到纯化。实验中原代培养的结果显示，原代培养的潜伏期约为4~7d，此期主要为MSC的贴壁生长阶段;第8天开始，相差显微镜下可以观察到贴壁细胞已形成多个大小不一的细胞克隆，说明此时细胞的有丝分裂活动开始变的活跃起来，第12~13天，细胞克隆彼此相连并铺满整个培养孔底面的大部分，此阶段细胞生长进入一个平台期，第14~15天，贴壁细胞开始铺满整个培养孔底面，原代培养结束。MSCs在髓骨中峰度较低，但其增生分裂能力十分活跃，因此通过离体培养，使体内环境下低峰度的骨髓MSCs实现扩增是可行的。当然以上的结果受到多方面制约，例如细胞密度、血清质量、血清浓度的年龄的影响比较大。
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, E+ n" l$ H# J" U) J3 j 2实验结果9 u# C. i+ a7 K' n3 L. m6 ]
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2.1形态学观察单纯贴壁筛选法原代培养的结果显示，1组中培养液过少细胞3天换液后细胞基本死亡该方法不适用；2组与3组3天换液后均可见细胞贴壁但细胞的密度过低（图1），细胞增殖缓慢甚至不生长直至死亡。所以该方法不适合年龄稍大的人群。密度梯度离心法结合贴壁筛选法原代培养的结果显示，3天换液后均可见较多贴壁细胞（图2）。原代培养的潜伏期约为4~7d，此期主要为MSC的贴壁生长阶段;第8天开始，相差显微镜下可以观察到贴壁细胞已形成多个大小不一的细胞克隆，说明此时细胞的有丝分裂活动开始变的活跃起来，第12~13天，细胞克隆彼此相连并铺满整个培养孔底面的大部分，此阶段细胞生长进入一个平台期，第14~15天，贴壁细胞开始铺满整个培养孔底面，原代培养结束。传代培养倒置相差显微镜观察，可见MSCs呈成纤维样紧密排列，漩涡样生长，胞核大、清晰，细胞呈长梭状，界限不清，细胞形态趋于同一（图3）。
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2.2人骨髓MSCs的生长曲线传代培养的细胞24h之内，绝大部分细胞贴壁且成纤维状，更换培养液将未贴壁的造血细胞排除，1~3天细胞生长缓慢，约4天进入对数生长期，6~7天传代培养的细胞达到90%的融合，进入生长平台期(图4)。
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6 F4 f5 U0 I$ ~$ Y) o" o0 ^ 2.3流式细胞仪分析流式细胞仪分析结果表明体外培养扩增的人骨髓间充质干细胞不表达造血细胞及其他细胞表面标志，其中CD45 99.66％的细胞为阴性;CD14 99.59％的细胞为阴性;CD34 99.71％的细胞为阴性，可排除为造血谱系细胞。可证明该细胞非造血干细胞而是骨髓间充质干细胞（图5、图6）。
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图1贴壁培养法接种3d可见有少量MSCs贴壁成梭形视野中有大量不贴壁细胞100（略）
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* ~' L2 G7 u$ R0 Q7 X3 O 图2骨髓单个核细胞接种3d，较多MSCs贴壁成梭形，血细胞和其他不贴壁细胞悬浮在周围 100（略）: f: m6 x' }; j! f
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图3传2代MSCs，可见MSCs呈成纤维样紧密排列，漩涡样生长 100（略）* J2 z% s9 G/ D
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图4传代后的细胞 1~3d细胞生长缓慢，约4d进入对数生长期，6~7d进入平台期 100（略）+ V2 a3 }8 F4 S) x
# E; I8 v: R9 S 图5流式细胞仪检测结果为cd45 99.66％的细胞为阴性;cd14 99.59％的细胞为阴性;（略）7 W0 _6 [ y) J, U5 U3 ?1 W: I, p9 i
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图6cd34 99.71％的细胞为阴性，可排除为造血谱系细胞。（略）) |" h5 |0 \- [! r' o2 W
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% ~2 g+ k5 \" W% Z8 q% k 3讨论
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MSCs在髓骨中峰度较低，但其增生分裂能力十分活跃，因此通过离体培养，使体内环境下低峰度的骨髓MSCs实现扩增是可行的。当然以上的结果受到多方面制约，例如细胞密度、血清质量、血清浓度的年龄的影响比较大。使用密度梯度离心法（淋巴细胞分离液）结合贴壁培养法能有效分离纯化成年人MSCs，用此种方法培养的细胞具有MSCs的一般生物学特性。本实验采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法和反复贴壁筛选法相结合，所获的细胞形态均一，增殖速度快，生长性状稳定；且操作简便，成本低。 |
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发表于 2009-3-3 11:51
发表于 2015-6-1 18:27
