急 加急 火急

fwyou

我有完全互补的上下游寡核苷酸 想退火使其互补4 ~4 w  [8 i% N; r3 j6 z7 L

$ p6 b: X2 C3 P具体步骤是什么？群友帮忙一下吧

cneagle66

95℃ 5 min, 然后每降低1℃保持90s, 直至降到30℃, 维持30min, 随后再降至4℃后, -20℃保存。

cneagle66

方法二6 t8 s4 q0 P( v  t* c. ^& C$ [
1.退火。退火buffer：10 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA。
+ I  K2 C6 N& o4 {2 [4 [$ ?- f3 @退火体系：两条寡核苷酸片段各2µl(1µg/µl)，1×退火buffer 46µl。+ b' i' Z5 l  H" Z/ u
95℃ 5min,然后自然冷却到室温。
1 C9 D! P) }* P% I% H2.载体酶切，回收（按照正常）: y" P* j7 p7 n8 C
3.连接。& j, j) T  E+ S: a4 R0 g1 H3 t

2 n; a" X* i) `7 S/ @方法三
- Q7 @, A6 P9 v+ T5 W5 K6 [' r% d5 }* N; L退火条件（供参考）：
3 `$ O1 M& x9 l/ `99℃ 2min
: k' R3 e' C4 h. o: {72℃ slow down 30℃ 90min: `! Z1 m: d3 {( t3 _$ L; y$ x1 o& a
4℃保存3 x9 D, ]9 ?3 T9 Y, G

hndxws

楼上的可以做到，但是做实验的时候不用那么复杂。我做的时候是95度5min，然后直接自然冷却至室温就可以了，也是没问题的。我曾经这样做shRNA的克隆