完美基因编辑：新方法可消除CRISPR-Cas的脱靶效应（附原文）

yinfuhua

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完美基因编辑：新方法可消除CRISPR-Cas的脱靶效应8 B0 E1 c1 I8 q; ]
2013-07-23 来源：biodiscover 作者：koo
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( j/ g+ }0 H5 {2 w# [$ N. a6 W  p1 `前段时间，麻省理工学院（MIT）的研究人员发现基因编辑工具CRISPR-Cas系统具有脱靶效应。近日，这个研究小组的负责人张峰教授表示，他们已经找到了影响CRISPR-Cas系统精确度的关键因素，这一发现将使该系统在人类细胞中的应用更安全。目前，这一研究发表在《自然-生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上。借助这项研究，科学家可以一次性破坏多个基因，从而提高治愈人类基因缺陷疾病的几率。
) H* o6 F( i% T7 n5 X% M% ^! a4 WCRISPR-Cas系统：革命性的基因编辑工具 但是具有脱靶效应. q' Y/ `" a! v- K! S
CRISPR-Cas系统是在大多数细菌以及古菌中发现的一种天然免疫系统，可用来对抗病毒以及其他病原体对细菌的入侵。科学家利用CRISPR-Cas系统可以对多种细胞的特定的基因组位点上进行切割，以便插入新的遗传物质。9 ?! Y3 e- X5 @; A/ @
在需要对目的基因的功能进行破坏，或者要进行目的基因替换时都可以使用CRISPR-Cas系统。科研人员如果要进行目的基因替换，就必须在目的基因被切除后，将新基因的模板复制到基因组中。- v2 r+ A3 d0 b$ T! |; ^
传统的建立转基因小鼠的方法是将小片段DNA整合到小鼠胚胎干细胞中，但是其耗时长，并且效率低。这项新技术为建立转基因小鼠提供了一个更快捷更有效的途径。
( g1 ?( v. g5 w. E7 x. _. z% mBroad研究所和麻省理工学院McGovern研究院的张教授介绍说，只需要三个星期，CRISPR-Cas系统可以同时将多个基因一次性编辑完成，其还可以被应用于在实验室中建立转基因细胞系。
9 p$ `2 j0 [0 q% B% c自从张峰教授的研究团队在今年一月首次对 CRISPR-Cas系统进行阐述后，来自世界各地超过2000个实验室已经开始使用该系统建立转基因细胞系或者转基因动物。
% a% X, u, i* s, ]# Z1 ^* m5 P目前已经发现有三种类型的CRISPR-Cas系统，其中其中第二型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA（guidance RNA）为核心，即CRISPR-Cas RNA引导核酸酶（CRISPR-Cas RNA-guided nuclease，CRISPR-Cas RGN）。不过，2013年6月来自美国麻省总医院的研究者发现CRISPR-Cas RGN也存在重大的局限性，它会在基因组的非目标位置产生非必要的DNA突变，也就是脱靶效应（off-target effect），这在一定程度上阻碍了研究人员将其广泛治疗应用。
# c' \! a, G6 U! g/ R( b新方法解决CRISPR-Cas系统难点 可减弱甚至消除消除脱靶效应0 E% v) E$ o! {" G5 d- B4 d: w
在最新研究中，为了寻找到最佳的基因组序列，研究小组成员Patrick Hsu and David Scott建立了一个计算机模型。“每一个基因都有成百上千的位点可以进行编辑。利用计算机模型，可以识别几乎任何一个基因。该模型可以帮助研究人员寻求最佳编辑位点。”麻省理工学院脑认知研究方向的助理教授张峰解释道。+ b; D5 O- `2 T# z0 ~$ R7 X1 u' p
研究人员发现有两种方式可以提高序列靶向特异性。第一种就是利用计算机模型。第二种方法就是调整导向RNA序列的量。在一般情况下，减小RNA序列的量可以减弱脱靶效应，但是不利于目的基因的裂解。对于每一个序列来说，高目标效应和低脱靶效应间存在一个最优的平衡点，这是可以计算出来的。& O( s) B( M7 t9 P
生物化学和分子生物学教授Michael Terns说：“这项研究的意义在于它对脱靶效应进行了系统和全面地分析，并且提出了减弱甚至消除脱靶效应的几种方法。”1 B- \* r; [9 i/ {/ P
最新研究结果表明，增长RNA链可以提高RNA的结合效率。所以张峰教授和他的同事们对RNA片段的结构进行了优化。张峰教授说，经过优化的RNA片段包含稳定的发卡结构，能够更有效的引导Cas9发挥作用。
9 A0 B3 M  S: f/ @' |0 w; V张峰教授团队下一步的研究计划是，进一步提高CRISPR-Cas系统的特异性，并建立用来研究大脑神经回路的细胞系和动物。通过破坏参与大脑神经回路形成和发育的基因，探究其是如何发挥作用以及在神经系统疾病中是如何受损的。
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; S5 b/ q+ e; L0 L$ M4楼原文 感谢huozhicb 提供

chips100

期待zhang 新版本的kit

huozhicb

DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases, k1 E# w5 q* t# M8 u! a8 i
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Patrick D Hsu,         David A Scott,         Joshua A Weinstein,         F Ann Ran,         Silvana Konermann,         Vineeta Agarwala,         Yinqing Li,         Eli J Fine,         Xuebing Wu,         Ophir Shalem,         Thomas J Cradick,         Luciano A Marraffini,         Gang Bao         & Feng Zhang" ^  Q3 s- h) I, r  W- |

& H4 I+ u5 F) f6 N' u  f/ zNature Biotechnology (2013) doi:10.1038/nbt.2647
. a5 N9 ]0 t2 R& y) q8 G: HReceived 30 March 2013 Accepted 30 June 2013 Published online 21 July 2013+ o4 j1 |6 y% k: W7 |' D
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Abstract; S7 n; D  r* r: q7 ^% E

' ^$ B5 o/ `2 l* i. J3 H, \& r& \Here we use the clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)–associated Cas9 endonuclease complexed with dual-RNAs to introduce precise mutations in the genomes of Streptococcus pneumoniae and Escherichia coli. The approach relies on dual-RNA:Cas9-directed cleavage at the targeted genomic site to kill unmutated cells and circumvents the need for selectable markers or counter-selection systems. We reprogram dual-RNA:Cas9 specificity by changing the sequence of short CRISPR RNA (crRNA) to make single- and multinucleotide changes carried on editing templates. Simultaneous use of two crRNAs enables multiplex mutagenesis. In S. pneumoniae, nearly 100% of cells that were recovered using our approach contained the desired mutation, and in E. coli, 65% that were recovered contained the mutation, when the approach was used in combination with recombineering. We exhaustively analyze dual-RNA:Cas9 target requirements to define the range of targetable sequences and show strategies for editing sites that do not meet these requirements, suggesting the versatility of this technique for bacterial genome engineering.

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谢谢！

POPOLD

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minibestcn

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