脂肪酸甲酯调控鼠骨髓间质干细胞增殖作用的研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:26 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：张越华  曾和平*  陈东风作者单位：华南理工大学化学科学学院功能分子研究所，广州 510641广州城市职业学院，广州 510405广州中医药大学，广州 510405
   ( G9 F. t: U1 o/ H! w6 M! k$ l
   , c1 z# Z* P6 b. ]
      . f( K& s' Z6 A8 ]/ Z
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      2 S5 p+ [' q; B# K6 n5 n
      3 {$ [6 P) O7 J
      ) z2 |5 a! P- c( R
      【摘要】  龟板浸膏采用石油醚、乙醚、二氯甲烷依次提取，将提取物进行甲酯化处理。用MTT（商品名为噻唑蓝，化学名为3(4,5)2唑噻(2,5)二苯基溴化四氮唑蓝）法及流式细胞仪，研究了甲酯化产物调控鼠骨髓间充质干细胞活性，采用气质联用和高效液相色谱技术研究了龟板浸膏提取物甲酯化产物的化学成分，结果表明，3个甲酯化样品都能促进干细胞增殖，而且都含有十六烷酸甲酯，当十六烷酸甲酯浓度为0.15 μg/μL 时能促进干细胞增殖，由此初步推断龟板浸膏甲酯化产物促进干细胞增殖与十六烷酸甲酯有关。这为中医药调控干细胞的研究提供重要的参考。
      【关键词】龟板干细胞增殖脂肪酸甲酯化
   　　1引言+ P# W" c( T5 Q( [) q5 W# c0 d

) u% x2 e3 A/ s7 p# m6 V# {

　　龟板浸膏能促进鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, bMMSCs）的体外增殖[1]，促进大鼠骨髓损伤后及局灶性脑缺血后神经干细胞增殖[2～4]，增强bMMSCs移殖后分化为神经元[5]；也可以在体外诱导成年大鼠bMMSCs分化为神经元样细胞[6]，经过较长时间诱导后bMMSCs还可能向成骨方向分化[7]。龟板浸膏能促进鼠bMMSCs增殖，但又不引起bMMSCs过度生长，有望为中医药调控干细胞的研究提供重要的参考。
0 N. ~2 E+ ^% W5 @6 l) }
' L$ V! x; B8 ~
/ E. D% S+ w* j2 B0 l3 q3 z
　　本研究的目的是试图了解龟板浸膏促进鼠bMMSCs的体外增殖的化学成分，进行甲酯化处理后能否促进干细胞增殖及其中的有效成分。龟板浸膏依次用石油醚、乙醚和二氯甲烷提取，得到溶剂提取物，将提取物进行甲酯化处理。用MTT法及流式细胞仪研究了提取物调控鼠bMMSCs活性，采用GCMS和HPLC技术研究了龟板浸膏提取物甲酯化产物的化学成分。3 d9 j4 B0 W2 V5 a  F5 j
1 L, E# N; K5 N/ w1 h- N5 d) N
　　2实验部分8 s3 u& ?4 @% L; u+ Q
2 M/ K+ ?" S* D# s) U, g
　　2．1仪器和试剂5 J1 w7 `% W0 o

　　Trace DSQ型气相色谱质谱联用仪（美国 Finnigan INC公司）；Summit 680型高效液相色谱仪， UVD 紫外检测器（美国Dionex 公司）；EPICS XLMCL型流式细胞分析仪（美国COULTER公司）。十八烷酸甲酯、十六烷酸甲酯、十八烷酸乙酯、十六烷酸乙酯、胆甾醇、甾酮均为色谱纯（日本东京TCI公司）；其它试剂均为分析纯。龟板浸膏由广东中医药大学提供。
4 H* _! K- u+ T( X$ `
　　2.2甲酯化样品的制备

　　称取龟板浸膏 2 g 3份，依次用250 mL 石油醚、乙醚和二氯甲烷加热回流 24 h后，分出各溶剂提取物，用旋转蒸发仪旋转蒸发至干，按照文献[8]加入含 5% HCl的无水甲醇 10 mL，水浴回流2.5 h。甲酯化后,加入水 40 mL，再用二氯甲烷提取 3 次(20，15，15 mL)，合并3次二氯甲烷提取液，自然挥干后，得到石油醚、乙醚、二氯甲烷提取物甲酯化样品，分别记为Z4、Z5和Z6；各称取 30 mg甲酯化产物进行促进鼠bMMSCs的体外增殖实验，称取 10 mg 用二氯甲烷定容供GCMS 分析。称取 10 mg用乙腈定容供HPLC分析。9 Q0 ]  J. h& T0 u# K4 B' `
4 M' [; k' C& V
　　2.3GCMS实验条件

7 s( p8 }; u' G- `4 J7 [

　　气相色谱条件： DB5 石英毛细管柱 (30 m0.25 mm), 载气为氦气，柱前压 50 kPa，进样口温度为 280℃。升温程序：60℃(不保留) ，以8℃/min升至280℃，保留20 min 。
  e# B& S  y  s5 V6 m, }

　　质谱条件：EI 源，离子源温度 250℃，轰击电子能量 70 eV ，电子倍增器电压 1.7 kV，质量扫描范围 28～500 amu 。联接: 直接式。! g. U9 G3 C' ?* l

1 R+ Q! b) Y; D: c7 I
　　高效液相色谱（HPLC）条件：采用 Supelco RP C18 (15 cm4.6 mm )反相色谱柱，乙腈和水作为流动相，在开始时乙腈/水（80/20，V/V），2 min 内梯度变化为100％乙腈，流速为1.0 mL/min，15 min 后流速变为 2.0 mL/min。检测波长为 210 nm。

　　用MTT法测bMMSCs增殖，所得数据用均数±标准差（±S）表示，采用SPSS统计软件进行统计分析。用流式细胞仪测试验证 MTT 结果。

　　3结果与讨论

　　3.1MTT法测bMMSCs活性$ |0 V; o  [+ ^0 ]3 u* D8 `4 ^

　　用 MTT 法测定bMMSCs增殖活性（A值）如图1所示，横坐标表示样品及浓度，如“Z40.75”表示Z4样品组的浓度为 0.75 μg/μL。

　　
+ v  ^5 N; Y5 D8 Z
　　图1噻唑蓝法测定样品中鼠骨髓间充质干细胞的活性（略）
- Z3 Z* w5 t; i2 Q$ }* X
　　Fig.1Determination of bone marrow mesenchymal stem cells (bMMSCs)activity in sample by 3(4,5dimethylthiazol2yl)

　　2,5diphenyl tetrazolium bromide（MTT） assay甲酯化样品 Z4 和 Z6 均能促进bMMSCs 增殖，与对照组比较，有显著性差异，P＜0.05。Z5的 A值暂缺，由于在测试过程细胞受污染，未能得到准确的A值，Z5调控bMMSCs活性的数据见图2，实验结果表明，0.09 μg/μL Z5能促进bMMSCs增殖。
  Q* S* j4 [+ Y4 ~. X% d' s1 D# H
  A5 G  T: ]) v

　　图2样品对鼠骨髓间充质干细胞增殖指数(PI)的影响（略）( W' q: k- l; v6 M( b
1 C; m3 M- C, i- D$ A- ~
　　Fig.2Effect of different sample on the proliferation index (PI) of activity# m) J  ?1 j- W1 R% y5 Z' D, K% k% w
0 q  u, X4 H. u; W- E8 ^9 R" t& d5 k
　　3.2流式细胞仪测试bMMSCs活性

7 l: ?0 x% E% e+ x  w# O

　　为了验证MTT法的结果，选取Z4 样品用流式细胞仪分析测试，对照组及样品组对bMMSCs活性的影响见图2和图3。bFGF阳性对照组浓度为20 μg/L，Z4及Z5 样品组浓度均为 0.09 μg/μL。Z4及Z5 样品组PI值虽低于阳性对照组，但高于空白对照组，且各组之间比较有显著性差异，由此说明0.09 μg/μL 的Z4和Z5样品组均能促进bMMSCs增殖，这与 MTT 法结果一致。
) f. p1 ?  b, Q' z' p. a6 J8 A
　　图3流式细胞仪测定鼠骨髓间充质干细胞活性（略）4 j6 w  h* @$ L, J2 A8 U2 W

　　Fig.3Determination of bMMSCs activity by flow cytometry
* g$ V, j+ e( E8 c2 z
3 d& O2 j" V# ^. _# l& `0 n6 Z
( Z  v, `. b5 {* `, n
　　a. 空白对照组（control group）； b. bFGF 阳性对照组（bFGF group）; c. Z4; d. Z5。/ Y8 E* V. c: |( j+ G5 w
1 m+ Y0 V/ h' h& q8 o
　　3.3GCMS 分析结果" V6 p3 @) [8 [+ M
9 }$ i8 ?9 U7 M: f/ T

　　在上述GCMS条件下，对3个甲酯化样品进行分析，对总离子流色谱图中每个色谱峰进行质谱扫描后得到质谱图，经过质谱数据库检索，人工谱图解析，初步鉴定出甲酯化样品的主要成分是脂肪酸甲酯，并按色谱峰面积归一法计算各组分的相对百分含量（如表1）。& _+ Q) R, d5 u* t
, X3 I; o% Z0 Y; ]

# H& {/ [( f7 I
　　GCMS结果显示，在3个甲酯化样品中，十六烷酸甲酯、9十八碳烯酸甲酯、十八烷酸甲酯含量较高。, X6 w1 `! T$ G9 y! i1 Q* v2 M
7 p7 d1 ]. v+ W, b3 }: N
5 r8 V+ }) M7 W* X
" Q7 d. ~) {* ~7 ^* K7 v3 W
　　脂肪酸甲酯化的方法有多种，常用酸化的甲醇或 12%～14%（W／V）的BF3甲醇溶液作为甲酯化试剂，但是，BF3甲醇溶液或浓硫酸甲醇溶液作为甲酯化试剂时，易引起多烯脂肪酸的分解。为防止不饱和脂肪酸被破坏，使用含5%HCl的无水甲醇，在水浴中回流2.5 h，甲酯化效果良好，但回流时间不宜过长[8]。& M" @' b  |* x0 D: k6 I

　　表1Z4、Ｚ５和Z6的化学组分（略）+ n$ H) n2 [+ S# |+ h% X
* z: p5 ?5 c  I& j5 Z! W) H* l
　　Table 1Ｃhemical components of Z4, Z５ and Z6
( Z6 n  I- Y( N! s! u) [
　　图44个样品高效液相色谱图（略）8 T1 q2 W! g8 l2 W* X6 m
+ k5 k: `9 K! Y; m; }2 o; [
　　Fig.4High performance liquid chromatogram of four criterions

　　3.4HPLC分析结果% h) ]$ X: h5 F

8 o, q2 z6 e8 Q
# E; A+ `0 d7 t9 X7 s' V+ e# \
　　根据 GCMS 的分析结果，购得9个物质作为标准品，其中包括十六烷酸甲酯（S1）、十六烷酸乙酯（S3）、十八烷酸甲酯（S4）、十八烷酸乙酯（S6）、胆甾醇（S7）、甾酮（S9）。通过 HPLC 进一步鉴定样品部分化学成分，结果表明甲酯化样品中都含有十六烷酸甲酯，这与 GCMS 的分析结果相吻合，如图4和图5所示。
3 l  O& L6 d" ?, x
　　图5Z4、Z5和Z6 的高效液相色谱图（略）# j) `, ?+ S6 L' T$ p+ p' @/ j

　　Fig.5High performance liquid chromatograms of Z4，Z5 and Z6* a. g- V3 Z: y) U1 Z4 {* Z5 x

　　在HPLC条件下，标准品中4个甲酯、乙酯的分离效果较好，甾醇、甾酮虽有色谱峰出现，但峰形不好。

　　图6噻唑蓝法测标准品的鼠骨髓间充质干细胞活性（略）& q+ z! o8 g( x# j! n) ^% e* j; K

　　Fig.6Determination of bone marrow mesenchymal stem cells (bMMSCs)activity of criterion by 3(4,5dimethylthiazol2yl)1 z* @2 G  g) Q# y! `7 L- H
- H9 F# N5 _! o
　　2,5diphenyl tetrazolium bromide（MTT） assay样品在该 HPLC 条件下的分离效果不理想，有些峰没完全分开，因样品的分析条件必须与标准品相同。/ I6 p! j& N% X. V4 \# C) w/ O0 q
2 ^8 o- n" I2 G1 {2 o
　　3.5化学组分与调控bMMSCs增殖的关系
1 U4 j% U- B" u" T& j' G1 J& g

　　GCMS 和 HPLC 分析结果显示，3个甲酯化样品中都含有十六烷酸甲酯。十六烷酸甲酯在 0.15 μg/μL 浓度时能促进bMMSCs增殖，但在高浓度时反而起抑制作用，如图6所示。由此初步推断3个甲酯化样品促进bMMSCs增殖与十六烷酸甲酯有关，这是一个新的发现，为中医药调控干细胞的研究提供重要的参考。将标准品按一定比例混合后，发现混合样品促进bMMSCs增殖效果比单个样品好。

8 K" l0 y1 l) a, }0 i" ?/ @8 S9 w
　　初步结果表明，龟板浸膏甲酯化产物中起到调控鼠bMMSCs增殖作用的物质中，十六烷酸甲酯起一定的作用，而且促进干细胞增殖不是单个分子的作用，而是多个分子协同作用的结果。
      【参考文献】
　　1  Zhou JianＨong(周健洪), Chen DongＦeng(陈东风), Li Hui(黎  晖) , Du ShaoＨui(杜少辉), Li YiＷei(李伊为), Deng RuＤong(邓汝东), Zhang SaiＸia(张赛霞). Journal of Guangzhou Unirversity of Traditional Chinese Medicine(广州中医药大学学报), 2005, 22(1): 35～38' D5 M* w' e) @
$ r/ X# d8 s3 t

　　2  Chen DongＦeng(陈东风), Du ShaoＨui(杜少辉), Li YiＷei(李伊为), Zhang Jin(张  进), Li Hui(黎  晖). Chinese Journal of Anatomy(解剖学杂志), 2002, 25 (4): 315～318  [/ c# l; c) i& j4 L( k

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　　3  Chen DongＦeng(陈东风), Du ShaoＨui(杜少辉), Li YiＷei(李伊为), Zhang Jin(张  进), Li Hui(黎  晖). Journal of Guangzhou Unirversity of Traditional Chinese Medicine(广州中医药大学学报), 2001, 18(4): 328～3316 V/ |* t0 |# A( ]& m

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　　4  Li YiＷei(李伊为), Chui XiaoＪun(崔晓军), Chen DongＦeng(陈东风), Du ShaoＨui(杜少辉), Li Hui(黎  晖), Zhou JianＨong(周健洪). Chinese Journal of Neuroanatomy(神经解剖学杂志), 2003, 19 (3): 321～324) E. N4 C7 O) J/ P- R

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　　5  Du ShaoＨui(杜少辉), Chen DongＦeng(陈东风), Li YiＷei(李伊为), Li Hui(黎  晖), Zhou JianＨong(周健洪), Deng RuＤeng(邓汝东), Zhang SaiＸia(张赛霞). National Medical Journal of China(中华医学杂志)， 2005, 85(3): 205～207; c6 W2 o* P8 Q. C0 X
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# d9 K' Y6 R$ U* s5 {1 f2 P( I
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　　6  Chen DongＦeng(陈东风), Du ShaoＨui(杜少辉), Li YiＷei(李伊为), Li Hui(黎  晖). Journal of Guangzhou Unirversity of Traditional Chinese Medicine(广州中医药大学学报)， 2003, 20(3): 224～226
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　　7  Li Hui(黎  晖), Zhou JianＨong(周健洪), Chen DongＦeng(陈东风), Du ShaoＨui(杜少辉), Li YiＷei(李伊为), Deng RuＤong(邓汝东), Zhang SaiＸia(张赛霞). Traditional Chinese Drug Research & Clinical(中药新药与临床药理)， 2005, 16(3): 159～161

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　　8  Sun SuＹa(孙苏亚), Li FaＭei(李发美). Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis(药物分析杂志), 1999, 19(6): 406～409

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