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作者：宋曲园1 ，马雅玲2作者单位：1.宁夏医学院,宁夏 银川 750004；2.宁夏医学院附属医院眼科,宁夏 银川 750004 + \1 q# v$ M7 W! y: t8 E- B) B
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【关键词】角膜缘干细胞；载体；移植
# P5 O5 R1 g5 V6 [4 I& u* u, Q 角膜是位于眼球前部的透明组织，起着眼球保护膜和“透光窗”的重要功能。角膜上皮的更新及创伤愈合过程，有赖于角膜缘干细胞的增殖、移行。当角膜缘干细胞缺失，会使角膜上皮增殖能力丧失、屏障功能下降，致使眼部出现不同程度的病理改变。角膜缘干细胞（Limbal stem cells,LSCs）的发现是近几十年来眼科学最重要的进展之一，其移植技术也是最先应用于眼科的成体干细胞移植技术。本文从LSCs定位鉴定、培养载体、临床应用三方面对其在眼科的应用进展进行阐述。
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# \4 q, @& h, v Y' @ 1LSCs的发现、定位及鉴定
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6 N% b7 }3 s8 J5 H% c! S 1971年Davanger等［1］发现角膜上皮有由周边向中心移动的特性，据此提出角膜缘干细胞存在的假说。1986年Schermer等［2］首次通过实验证明角膜上皮干细胞位于角膜缘基底层，尤其是Vogt栅栏区乳头状结构中的角膜缘基底细胞层;且增生方式为:干细胞→短暂扩充细胞→有丝分裂后细胞→终级分化细胞。目前关于角膜缘干细胞存在于角膜缘的实验证据有：
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& _ K! o# l6 b* @) o 1.1角蛋白的测定：角膜上皮表达3对角蛋白。其中相对分子质量为64 000的碱性角蛋白（K3）在角膜上皮细胞独特表达，AE5单克隆抗体是针对K3角蛋白的特异性抗体，其在结膜上皮表达阴性，而在角膜缘上皮细胞、角膜上皮表达阳性［2］。表明角膜缘基底细胞含有角膜上皮干细胞，提示角膜上皮再生的源头位于角膜缘。1 j0 w, l6 V- c) J, w/ F
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1.2角膜缘上皮细胞的克隆化培养：可通过细胞克隆化形成的3种细胞形态来判断细胞的增殖能力，即全克隆（代表极高的增殖力）、旁克隆（增殖力较弱）、部分克隆（全克隆至旁克隆的过渡）。角膜缘上皮细胞形成全克隆，并可多次传代，表明角膜上皮干细胞存在于角膜缘［3］。8 o M/ K6 F: z1 a) d$ d4 E
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1.3角膜缘上皮的细胞周期分析：Ki267是进入活跃细胞周期的标志，角膜缘基底细胞有少数可见染色，表明基底细胞中含有干细胞［4］。Tseng用5-Fu能明显抑制角膜上皮的生长，而对角膜缘的细胞影响较小，说明角膜缘基底层的细胞是一群慢周期细胞。! K8 R2 \$ I/ D# B' f b5 X
" k |6 p3 S: j) I* S 1.4用增生细胞核抗原评价细胞增生状态：Gan等［5］用其单克隆抗体对角膜、结膜及角膜缘组织进行检测，发现角膜缘基底膜处有大量阳性细胞，提示此处细胞比角膜上皮基底细胞具有更高的分裂增生能力。2 r& Q7 @ W% [3 t- p
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2LSCs培养载体的选择0 h) o1 ~: {; C
* O( S( I- m" S9 a% k$ K6 j 体外培养干细胞移植具有无免疫排斥反应、供体来源充足等优点，成为目前治疗临床上最棘手的双眼疾病患者的重要手段。既能保持培养细胞的生物特性，又具有良好的组织相容性、韧性的载体将使干细胞的移植成功率大大提高。为此，选择安全可靠的载体用于培养角膜缘干细胞已成为干细胞移植研究中的热点之一。
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_) T9 l1 R U# Z5 o* s5 P/ \ a 2.1天然载体材料4 F/ K, d" @& K* B9 x: p
7 m+ G- e( W7 R% ]8 A$ [) y 2.1.1胶原：胶原是从动物骨骼、筋膜中经浸煮、水解等多道工序提炼得来的，具有无抗原性、生物相容性好、可参与组织愈合过程的特点。Orwin［6］等众多研究者应用胶原作为载体培养角膜缘干细胞。但是胶原材料的稳定性较差，具有降解快、机械强度小等缺点，目前研究者正致力于应用精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸肽接枝改、聚环氧化物交联等方法，希望进一步改善胶原材料的生物学性能。
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2 Q! A3 q. l. t: j7 ]; ^ 2.1.2羊膜：2000年Koizumi等［7］以人羊膜培养兔角膜缘干细胞并自体移植，达到完全上皮化的效果。Schwab等［8］则将以羊膜为载体培养出来的角膜上皮细胞移植至自体患眼，全部术眼的症状消失，重建角膜上皮层取得成功。羊膜是人体中最厚的基底膜，研究发现其富含细胞生长因子、蛋白成分，可促进上皮粘附、生长、分化；其抗原成分低，移植后不被宿主排斥；抗微生物特性强，可降低术后感染的发生率。
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2.1.3角膜基质：角膜基质有完整的细胞外基质，可使培养的干细胞和上皮细胞紧密附着，促进细胞的生长；可对角膜上皮提供类似间质营养器的作用，有利于培养角膜上皮细胞的增殖反应。学者们［9］研究证实，以角膜基质片作为载体培养的角膜组织，其结构与正常生理条件下的角膜组织结构近似。其天然结构及成分的优势，使得它作为载体的潜力巨大。2 E2 Y y; e$ X& c6 z& t
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2.1.4其他：1997年Leon等［10］首次报道了天然珊瑚礁羟基磷灰石应用于人工角膜的动物实验。2001年Rama等［11］将来源于患者对侧健眼的自体角膜缘干细胞培养于纤维蛋白基片上，再移植到患眼角膜上。
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2.2人工合成载体材料：聚乳酸、聚羟基乙酸及其共聚物是一种典型的可生物降解的高分子材料，已被广泛地用于骨、软骨、皮肤等组织的载体材料，在角膜组织工程方面，目前多按一定比例混合形成均匀的羟基乙酸-乳酸单体的聚合物作为载体培养角膜细胞［12］。1997年Pelligrini等［3］以治疗性亲水的软性角膜接触镜为载体种植体外扩增的角膜缘干细胞，并自体移植到单眼眼表损伤患者，取得了成功。
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' p1 F0 T, S" k3 G 2.3免载体LSCs培养：2004年Nishida等［13］尝试免载体体外培养角膜缘干细胞。他们将用丝裂霉素C处理了的兔或人角膜缘干细胞培养在温度反应培养皿中，测定显示这种细胞片与天然的角膜组织相似且易分离。随后他们将细胞片直接移植于受体暴露的角膜基质表面，可见移植片均匀地覆盖在整个角膜表面，免疫组化显示有角蛋白K3表达。
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3LSCs的应用4 ^. I1 _& `- z$ V/ J! L& ?' D
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角膜缘干细胞缺乏是以正常角膜上皮被结膜上皮侵犯和替代为特征。角膜缘干细胞移植术是用自体或同种异体角膜缘干细胞替换功能不良的角膜缘组织，通过供体干细胞的增生分化及细胞的向心性移行来修复和稳定受损的角膜表面。下面按干细胞来源对角膜缘干细胞的应用作一简要介绍。
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3.1自体角膜缘干细胞移植：现代角膜缘移植术的理论是1989年Kenyon等［14］在总结Thoft结膜移植术经验的基础上，将自体健眼包括角膜缘含干细胞组织在内的球结膜片移植到患者受损的角膜缘部，术后取得良好效果。自体移植不存在免疫排斥，成功率高，日益成为临床上一种成熟的手术方式。$ X( l( r" ^. N/ L0 h
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3.2异体角膜缘干细胞移植：自体角膜缘干细胞移植适应证的限制迫使人们将注意力转移到异体角膜缘干细胞移植上。1994年Tsai和Tseng［15］等对16例由不同原因引起的角膜缘功能缺陷眼实施了来源于尸眼的异体角膜缘移植，术后口服环孢素A，经过平均18个月的观察，未观察到明显的免疫排斥反应。并发现术前采用HLA配型，术后应用环孢素A或FK-506等免疫抑制剂，细胞纯化技术去除呈递抗原的Langerhan细胞等方法均可在一定程度上减少异体移植术后的免疫排斥反应发生率。
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3.3体外培养的角膜缘干细胞移植术：由于角膜缘干细胞自体、异体移植术受到取材和移植排斥等多方面的限制，培养角膜缘干细胞作为移植的来源成为大多数学者的研究焦点。培养人表皮细胞和口腔上皮细胞已成功地用于自体移植，使人们联想到利用体外培养人角膜缘上皮干细胞进行移植。
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$ m# i% ?, D- c 3.3.1自体角膜缘干细胞体外培养移植术：早在1993年Lindberg等［16］将培养的人角膜上皮移植到裸鼠皮下，得到了正常的角膜上皮及基底膜成分。这为临床移植培养的干细胞提供了理论依据。随后Pellegrini等［3］及Schwab等［8］分别借助软性角膜接触镜和羊膜体外培养扩增自体角膜缘组织，移植治疗患眼，成功实现了眼表重建。而羊膜以其自身独特的优点，被认为极有可能成为最佳的载体。自体角膜缘干细胞体外培养移植术既解决了自体干细胞来源有限的问题，又避免了异体间的排斥反应，故该术目前被认为是较理想的角膜缘干细胞移植术。( L9 E- D# Y6 [! |
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3.3.2异体角膜缘干细胞体外培养移植术：2000年潘志强等［17］采用培养的同种异体角膜缘干细胞羊膜移植片治疗角膜缘功能障碍，6例患者短期治疗效果良好。而2001年Koizumi等［18］以羊膜为载体体外培养异体角膜缘组织移植治疗11例患者的13只角膜缘干细胞完全缺失的患眼，术后应用免疫抑制剂，并进行11个月的随访，发现有3例发生了上皮排斥反应。由于体外培养的同种异体角膜缘干细胞植入异基因受体，虽然其免疫原性可随培养时间增加而降低，却不能从根本上避免免疫排斥反应的发生。如能通过基因敲除技术，敲除细胞上主要组织相容性抗原复合物分子的表达，移植免疫排斥将会被彻底解决。
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N/ L) m* x( O4 V 3.3.3其他来源的角膜缘干细胞移植术：胚胎干细胞是指存在于早期胚胎中，具有多分化潜能的细胞。1998年Thomson和Gearhart小组［19］分别报道了他们已建立人胚胎干细胞系和人胚胎生殖细胞系，引发了人们的极大兴趣。2001年喻瓴等［20］将大鼠胚胎干细胞与兔角膜缘上皮细胞共同培养以诱导其分化，由胚胎干细胞分化出的细胞具有上皮细胞表型，并表达角膜上皮细胞特异性标志物细胞角蛋白K3/K12。随着人类对角膜缘干细胞认识和研究的逐渐加深，应用离体培养的角膜缘干细胞制造人工角膜，不仅会为角膜缘功能衰竭患者带来希望，并且可为临床眼用药物的筛选提供细胞模型，被认为具有最广阔的应用前景。5 t/ O1 V4 B+ A4 [# U7 t1 p
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发表于 2009-3-3 12:23
发表于 2015-5-21 19:15
