脂肪源性干细胞的研究进展 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:17 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：陈光平，汪海滨，罗盛康作者单位：广东医学院研究生教学基地广东省第二人民医院，广东广州510317




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      【摘要】  组织工程化脂肪在充填软组织缺损及外科整复方面有着广阔的应用前景。脂肪源性干细胞可作为脂肪组织再生工程种子细胞的理想来源。本文主要介绍脂肪源性干细胞的研究进展以及其在脂肪组织工程领域中的应用。
      【关键词】脂肪组织；脂肪干细胞；间充质干细胞；综述文献
   脂肪组织工程在修复衰老变形组织、烧创伤创面的缺损和先天性畸形中有着广阔的前景。本文就脂肪源性干细胞(简称脂肪干细胞)的研究进展及其在脂肪组织工程领域的应用作一综述。5 a* ^2 x/ T" A3 O
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　　1脂肪干细胞的生物学特性+ {' S5 g6 M6 Z2 J
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　　2001年，Zuk等［1］首次从人抽脂术抽取的脂肪组织中分离出一种多向分化干细胞，因其与骨髓间充质干细胞(BMSC)形态相似而称为脂肪间充质干细胞（ASC）。此后几个研究小组也先后采用相似的分离方法分别从脂肪组织中分离得到ASC［23］。近年来许多研究表明，脂肪干细胞具有向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化的多分化潜能,是一种理想的种子细胞［47］。因脂肪干细胞具有分化为脂肪的潜能，且其具有易获得性、可迅速扩增、不易衰老等特点，目前脂肪干细胞已成为脂肪组织工程中种子细胞的研究热点。

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　　1.1脂肪干细胞的分离、培养) c- P( S1 k: q% p. {
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　　脂肪干细胞在脂肪组织中含量很低，要利用脂肪干细胞就必须进行体外分离培养扩增。常用的方法是将剪碎的脂肪组织消化离心，倾去上层脂肪及上清，获得基质血管层，将其收集到培养瓶中培养，除去未贴壁的红细胞和残渣，剩余的细胞群体称为加工过的脂肪吸取物。原代培养的细胞中贴壁的细胞较少，细胞生长至融合后传代，传代后的细胞称为脂肪干细胞。平均每300mL脂肪组织可获得2108～6108 个这样的细胞［8］。( k: t6 B/ O  o9 E8 B

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　　体外培养条件下，ASC的培养不像BMSC对培养基中胎牛血清的来源和质量有严格要求，DMEM、αMEM、RPMI1640是ASC的常用培养基［9］。一般只添加体积分数为10％的胎牛血清，并且血清无生产批号限制。在传代培养中，平均倍增时间为60h。并表现低水平衰老，1代时细胞没有出现衰老现象，10代时少于5％细胞出现衰老，15代时衰老细胞比例仍低于15％，这表明脂肪ASC体外扩增能力很强，传代培养易于获得大量有分化能力的细胞［1,10］。
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　　１．２脂肪干细胞的鉴定8 Y3 a0 y: z# A; r5 R5 T+ P* {

　　Zuk等［1］认为，ASC可能由多种异源性细胞构成，其中包括内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及前体脂肪细胞等。但部分学者采用流式细胞仪和间接免疫荧光等方法，分别以因子VIII、平滑肌蛋白、ASO2的特异单克隆抗体鉴定ASC中是否存在内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞，结果发现前两种单克隆抗体抗阳性染色的细胞所占比例较少，绝大多数为ASO2单克隆抗体阳性染色的细胞，提示ASC主要由成纤维细胞以及来自间叶组织的细胞构成，仅伴有少量内皮细胞与平滑肌细胞［1］。虽然Zuk等［1］认为上述细胞在ASC中的含量甚低，不可能定向培养分化为其他组织细胞，但进一步确认和识别真正的ASC的表面蛋白及其基因仍是必要的。
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　　Gronthos等［11］已着手这方面的研究，并发现了在缺少分化刺激因子的条件下，ASC表面标志蛋白有HLAABC、CD9、CD10、CD13、CD29、CD34、CD44、CD49、CD54、CD55、CD59、CD105、CD146、CD166；经过14d的诱导培养后, ASC虽然发生了形态变化，表现出成脂细胞、成软骨细胞、成骨细胞等分化的特征，但表面蛋白的表达却大致与未分化前一致，这些表面蛋白与BMSC的表面蛋白很相似。ASC和BMSC均表达CD13、CD29、CD44、CD105，均不表达CD31、CD34、CD45、HLADR。虽然从分子标识上看ASC和BMSC具有相同的表面粘附分子和受体分子，但两者仍有区别。ASC表达CD49d，而不表达CD106，BMSC则相反［12］，造成这种区别的机制可能与细胞所处的微环境及具体功能有关。3 H' b1 u, L% T* P6 a* r9 }  J# M6 [

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　　间充质干细胞没有特异的表面标志已得到公认。免疫组化染色和流式细胞仪检测等免疫表型的结果对确认脂肪干细胞有辅助作用，但鉴定脂肪干细胞的最好方法是进行多系定向诱导，并进行相应检测以确定诱导成功［13］。

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　　2脂肪干细胞的成脂分化' K! |3 {- \3 }( O: n

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　　ASC在特定促进因素下可分化为脂肪细胞，且经过长时间培养，仍可维持此种分化能力［14］。脂肪细胞分化过程大致如下：（1）脂肪干细胞向脂肪细胞定向分化，形成脂肪母细胞（一种尚未出现脂滴的梭形细胞）；（2）脂肪母细胞经过生长抑制、克隆性增殖，形成前体脂肪细胞（此时细胞刚开始出现脂滴）；（3）前体脂肪细胞经过生长抑制、克隆性增殖和一系列基因表达的变化，形成不成熟脂肪细胞或多室脂肪细胞（内含大量小脂滴）；（4）多室脂肪细胞随着脂肪在细胞中的沉积，小脂滴逐渐汇集成一个大脂滴充满脂肪细胞的大部分，形成成熟脂肪细胞或单室脂肪细胞，成为成熟的脂肪细胞。- B" S9 A% a% l1 z9 Y; [. i
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　　目前普遍认为脂肪母细胞是脂肪干细胞接受相关刺激，如寒冷、激素、生物活性因子、体外实验性诱导剂刺激后，由多能变为单能定向分化的起始阶段。此阶段仍具有干细胞活跃增殖的特性，是否有特异的基因表达，尚未见文献报道。前脂肪细胞作为脂肪细胞的确定前体细胞，人们对它的研究很多，包括各种实验动物和人皮下白色脂肪，血管间充质等部位的棕色脂肪和鼠胚胎前脂肪系3T3以及骨髓起源的前脂肪细胞［15］。前脂肪细胞的增殖与分化的关系为：生长停顿—生长再续—细胞分化。其中生长停顿是必要的第一步，由单层细胞形成产生的接触抑制或是药物的作用、营养因子缺乏引起。
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　　近年来，对培养脂肪干细胞系的研究获得了很多有关促进脂肪干细胞分化的转录因子的数据。目前已经鉴定出的对前脂肪细胞的增殖和分化有直接影响的转录因子主要有3种—过氧化物酶增殖体（PPARs）、CCAT增强子结合蛋白（C／EBP）、ADD1。PPARs在前脂肪细胞的成脂分化中起主要调控作用，C／EBP与ADD1可启动和维持前脂肪细胞向脂肪方向分化，PPARs与配体结合激活脂肪发育过程中关键基因的转录。脂肪酸转运蛋白(FA)也是该阶段早期表达产物之一。类胰岛素生长因子1( IGF1) 及其受体在此阶段也有表达。
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　　脂肪细胞分化过程中，其细胞形态、膜表面蛋白、胞质内容物和基因表达均发生了极大的改变。可以根据这些变化来判定脂肪细胞的分化状态。(1)细胞形态。脂肪细胞贴壁后最初为小圆形，核／浆比例增大，4d后即可观察到细胞渐成梭形，7d后梭形细胞扩大增殖。此时在形态上和皮肤成纤维细胞很相似，不同之处在于脂肪细胞开始积聚脂肪颗粒，9d时可观察到细胞由梭形渐变成椭圆形，积聚有脂肪颗粒的细胞增多。到2周时分化成多脂滴或单脂滴的细胞。(2)脂肪细胞内的脂肪含量。对前脂肪细胞分化结果的定性研究一般采用油红O或甲烯兰染色，将培养物用体积分数为0.01的甲醛等渗盐缓冲液固定，漂洗，油红O染色后，以异丙醇萃取，用分光光度计测细胞内脂肪含量。一般来说，前脂肪细胞在培养的前3d即开始有脂肪的积聚，1周后积聚量明显增高，2周后达到高峰［16］。(3)脂肪细胞分化不同时期的标志物。细胞开始分化后，随时间的推移出现PobmRNA 以及 LPLmRNA这两种转化早期的标志物，其中前者是体内及体外脂肪状态的独特标志物，此时如果外界条件改变，解除了这种生长停顿，则前脂肪细胞的早期标志物消失，重新出现生长和增殖，DNA合成增加。否则，将出现磷酸脱氢酶(GPDH)mRNA这个晚期标志物，并最终变成脂肪细胞。除了上述分化标志外，脂肪细胞在分化过程中还表达其他的标志物，如早期标志物FA transport，中期标志物FAS、HSL、ACC、aP2、GPAT、GDPH，晚期标志物ACBP、Leptin。可以用PCR技术检测这些物质的mRNA来判断脂肪细胞的分化阶段。
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　　3脂肪组织工程中脂肪干细胞的应用

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　　目前，将脂肪干细胞应用于脂肪组织工程的研究刚刚兴起，研究还都处于细胞和实验动物阶段，还没有体外构建的脂肪组织在体内稳定长期存在的报道。当前，脂肪干细胞应用于脂肪组织工程主要有两种方式：⑴用脂肪干细胞体外扩增一定量的细胞数后结合适当的支架材料和一定的生物活性物质应用于患者；⑵用脂肪干细胞体外构建脂肪组织后移植［17］。有研究者利用脂肪生成所需的环境和细胞因子吸引、招募和趋化周围的脂肪干细胞，在原位诱导分化成脂肪组织。Kimura等［18］将Matrigel凝胶和FGF2细胞生长因子一起注射到大鼠的皮下组织，以吸引邻近的结缔组织中脂肪干细胞迁移过来形成新的脂肪组织，但仅有微小的脂肪组织生成。Patrick等［19］将PLGA泡沫材料和脂肪干细胞移植到大鼠的皮下以研究脂肪组织的形成，结果显示有脂肪组织生成，但是持续到2个月后脂肪细胞数量开始减少，5个月后就完全被吸收了。Cho等［20］将改进性能的PLGA支架材料做成中空的圆顶状，移植入裸鼠的皮下，随后将包被有脂肪干细胞的纤维蛋白凝胶注射于其中，6周后发现有脂肪组织形成，而且支架结构完好稳定。但目前尚未发现脂肪组织存活更长时间的实验报道。究其原因，可能是脂肪干细胞的数量、支持材料的生物相容性和促进脂肪细胞生成的微环境影响了工程化脂肪组织的长期稳定存在。近年来已有利用旋转式细胞组织培养系统(RCCS)结合微载体培养技术对脂肪干细胞进行规模化培养的研究［21］，有望解决脂肪组织工程中种子细胞数量不足的问题，为脂肪干细胞应用于脂肪组织工程的研究进一步奠定基础。

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　　4脂肪干细胞研究存在的问题及展望

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　　虽然脂肪干细胞的研究已经取得很大的进展，但依然存在一些问题。(1)脂肪干细胞虽然可以在诱导下向脂肪组织分化，但目前诱导分化的机制尚不清楚。(2)研究［22］发现，来自于不同个体、不同部位的脂肪干细胞的分化能力有明显差别，其具体原因尚不清楚，但却为进一步探寻脂肪干细胞在体外诱导分化的条件和最佳供体、供区提供了新的课题。(3)体外培养的脂肪干细胞最终要移入体内进行研究，然而用人体来做实验是不可能的，所以必须建立动物模型。(4)种子细胞最后移入体内还需要有合适的载体（即生物材料），目前关于生物材料的研究较少，所以特异性组织生物材料也将是一个重要而广阔的研究领域。& a7 Y+ c5 d3 z

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　　现有研究结果表明，ASC与其它的干细胞相比有显著的优越性。脂肪是人体来源最丰富的组织。相对于人体其它组织，脂肪干细胞更易于通过脂肪抽吸术等方式大量获得，患者的痛苦小，不会对人体产生明显的生物学和解剖学不良后果。研究［2］发现250～500mL脂肪抽吸组织可产生超过108个细胞，并且这种细胞来自自体，具备免疫相容性，不会产生排斥反应和伦理学问题；与骨髓干细胞不同, 脂肪干细胞的生长和增殖不需要特殊血清，并且在体外增殖速度快，不必进行永生化处理就能获得足够的细胞用于移植，这为临床移植提供了充足的细胞来源。因此，脂肪干细胞具有用于脂肪组织工程所需细胞的理想特性。以脂肪干细胞作为种子细胞的脂肪组织工程有望在乳房再造术、除皱术及凹陷畸形矫正术中发挥作用。
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