新生小鼠脑提取液对成年小鼠侧脑室下区干细胞增殖的作用 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:37 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：王成蹊罗焕敏肖飞肖美玲余锐作者单位：广东药学院药科学院，广东  广州 510006 & c& U/ s; S1 o5 a3 o" x
   . v& q' j. {6 U9 P
   9 a6 l" ]& u* f7 }: x  m) p6 ]+ H. f
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      # e" v: {) f: M( C: ]% k  w, ~' F! q
      3 z+ `" ^7 p6 ]2 ]6 }5 Z8 H
      【摘要】  目的研究新生小鼠小脑提取液（ECNM）对成年鼠侧脑室下区神经干细胞的影响。方法采用脑立体定位技术注射新生鼠小脑提取液至成年鼠侧脑室，通过Nestin和Musashi免疫组化染色，显示提取液对神经干细胞的影响。结果高剂量组(25 mg/ml)室下区的神经干细胞明显增多（P＜001），低剂量组（25 mg/ml）也有增加（P＜001），溶媒对照组无明显阳性染色。结论新生鼠小脑提取液能够促进成年鼠侧脑室下区神经干细胞分裂、增殖。 . A. m3 }/ Q2 F' R4 }
      【关键词】神经干细胞；脑立体定位技术；新生小鼠小脑提取液（ECNM）；侧脑室室下区；Nestin；Musashi4 d7 o2 b' ]; ~. z" c


　　1材料与方法

　

　　11 实验动物
: S! \6 v# q# `5 B, H1 M
　　成年雌性昆明种小鼠，清洁级，体重25～30 g，10～12周龄，广东省医学实验动物中心提供，标准鼠饲料饲养。

　　12试剂及仪器

　　Recombinant Human FGF basic（rhFGF）购于R&D公司，批号：AU824041。3K18型冷冻离心机为Sigma公司生产。 Mushashi抗体购自Chemicon公司，批号：23090287。Nestin抗体、二抗（兔抗鼠）及SABC免疫组化试剂盒均为武汉博士德公司产品。DY1型脑立体定位仪购自天津市医疗器械研究所。

　　13实验方法2 Z( Q9 c8 m# C

　　131 新生小鼠脑提取液（ECNM）制备3 `! q, R7 \6 [; K8 E: b+ I

　　取新生小鼠（＜24 h）小脑，按1∶4湿重（g）体积（ml）比加入人工脑脊液并匀浆。匀浆液置4℃冷冻离心（1 000 g），取上清液置4℃冰箱保存备用。人工脑脊液组成：NaCl 1240，MgSO4 10， KCl 30， KH2PO4 12， NaHCO3 250， CaCl2 10，pH 72～74。

　　132 动物分组

　　40只小鼠随机分为4组（每组10只）：人工脑脊液（溶剂）对照组，rhFGF组（25 μg/ml），ECNM高剂量组(25 mg/ml)和ECNM低剂量组（25 mg/ml）。
- w0 x& ?6 L- F) K7 c$ H
　　133 动物给药* l( H# i! _- S1 ]9 \
; G3 i. }" h( F
　　戊巴比妥钠麻醉小鼠（40 mg/kg），固定于脑立体定位仪上，进行侧脑室注射。坐标：后囱前3 mm，旁开15 mm，进针15 mm。双侧侧脑室各注射5 μl。单侧注射时间5 min，留针5 min。+ Y$ g' h' D0 w0 k  X

　　134免疫组化染色: N) O( ^. h) Z3 `3 Q; x& E1 n
3 H4 W1 L* J( T  i9 X
　　手术7 d后用4％多聚甲醛灌注固定，石蜡包埋，连续冠状切片（5 μm厚），每4张取一张，每个标本取10张切片，按照常规方法分别做Nestin和Musashi免疫组化染色，每种抗体染5张切片。苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。

　　14 统计学分析
( C: x9 J* }  k0 o5 z
　　用SPSS100数理统计软件进行统计学分析，各组比较用方差分析，组间差异的显著性用t检验。" P* w  b, F( g2 l3 M/ |- B

　　2 结果) ]% F1 w& T0 A& q+ u9 {
1 z9 M0 ~3 w: r. v6 A
　　21 形态学观察% t7 e; n9 o" Z, H& O( s2 K* [
5 u  X: I4 }4 n6 K6 f  ^/ l" I
　　高剂量组：侧脑室下区（SVZ）可见阳性细胞较密集，细胞质染色呈深棕色，阴性细胞由于苏木素染色而呈蓝色。低剂量组：室下区阳性细胞数较少。两组阳性细胞形态与阳性对照组类似。溶媒对照组：基本无明显阳性细胞，细胞均为蓝色。侧脑室室壁上细胞均呈深棕色，是免疫组化过程中切片边缘未被洗掉的一抗造成的假阳性结果。Nestin与Musashi免疫组化、染色结果基本一致（见图1、图2）。3 H; T9 Q$ }9 U

　　22形态计量学分析

　　在光镜下（250），每张切片随机取侧脑室下区3个视野进行细胞计数并计算该视野下阳性细胞出现率（阳性细胞/细胞总数）。与溶媒对照组比较，其余3组均有显著性差异。与阳性对照组比较，高剂量组P＞005；低剂量组则P＜005，说明两组间差异有统计学意义，低剂量组效果不及阳性对照组和高剂量组（见表1）。表1 免疫组化染色后细胞阳性率（略)3 z; P% }0 N! }' C- Z  p' N

　　3讨论
; y* E- ?; g$ N; c  m
" ]- b6 u( h4 y% F, P( k

　　近来发现，在成年哺乳动物脑内仍保留有干细胞〔1，2〕，对脑内固有干细胞进行干预，促进其分裂、增殖有可能成为治疗AD的新方法。我们设想在脑胚胎发育过程中可能有某种或某些促干细胞分裂因子诱导早期的神经干细胞分裂、增殖，以达到成体后脑的神经元数量。章培军等在实验中发现，不同胎龄的小鼠胚胎小脑提取液均能促进体外培养的小脑神经元的存活〔3〕。Bianchi等制备发育期内耳组织提取液，发现能够促进听觉神经细胞的生长，并证实提取液中的促生长物质不同于已发现的神经生长因子〔4〕。以胚胎脑组织移植修复脊髓损伤〔5〕或以各种神经营养因子培养脊髓神经细胞〔6〕也有许多研究。, K+ A2 x  h) }2 J& E% Q
" h6 F& K( j& Q% P* c1 t1 e
　　Nestin和Musashi均为神经干细胞特征性标志物〔7～9〕。本实验同时使用Nestin和Musashi两种免疫组化方法鉴定成年鼠脑内神经干细胞的分裂、增殖情况，特异性更高。实验所用小脑提取液的制备，全过程均在4℃冰浴中完成，以防温度过高而导致营养因子活性降低或丧失。有关神经干细胞的研究证实，脑部的损伤也会造成局部神经干细胞增殖〔1，10〕，故本实验使用的所有切片均不包括脑立体定位注射时进针的部位，以避免因脑组织损伤引起的干细胞增殖干扰实验结果（假阳性）。体外实验研究表明，bFGF能够非特异性地促进神经干细胞分裂与增殖〔7，11〕，故本实验用其作阳性对照药。

　　本实验室前期工作已证实，小脑提取液可促进成年鼠基底前脑及海马神经干细胞增殖〔12〕。本研究进一步证实小脑提取液对侧脑室下区神经干细胞也具有促进增殖的作用，可作为前期工作的补充，说明在基底前脑、海马以及侧脑室下区均存在神经干细胞，且在小脑提取液作用下它们均能分裂、增殖。高剂量组和低剂量组与溶媒对照组比较均有显著意义（P＜001）。高剂量组的作用与阳性对照组相当（P＞005）而低剂量组不及阳性对照组（P＜005）。本实验再次证实小脑提取液中确含有能够促进神经干细胞分裂和增殖的物质，这为下一步寻找脑内特异性的促干细胞分裂因子奠定了更加坚实的基础。此外，在实验中溶媒对照组未见任何Nestin和/或Musashi阳性染色。从理论上讲，尽管成年动物脑内神经干细胞极少(1/300)〔13〕，但也应该可以染出来。出现这种“全阴性”可能的原因是未经干预的干细胞Nestin和Musashi蛋白含量低以至于未达到实验检测的灵敏度所致,也有可能是抗体的灵敏度不够高造成，确切的原因有待今后更深入的研究。; ]4 N- _5 o1 F$ z7 a
      【参考文献】
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　　13 Rietze RL，Valcanis H，Brooker GF,et alPurification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain〔J〕Nature，2001；412 (6848):7369

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