PCR克隆基因酶切的问题

daviddow

如何解决酶切后没有条带的问题？
% s. R# Q5 |: w0 o- jPCR产物：N42
: l! g( Z0 K3 U9 O; X) f. V/ m ' u, h9 R! \+ h- T5 A
; K. [4 ]' J/ U, e# K, z5 Z
酶切后：PCR-N4-BamH
) V! O  T6 I! b. \. L# @( n0 [6 W' I; G9 I- V1 l  k$ Z8 b

$ G) _* t; S9 e& c6 M5 V
! ^: j. d% J2 t' I1 F酶切的条件是：& j. J8 O7 Y/ C0 j6 k$ w9 o7 j
Nuclease free water     40ul
9 q6 H: r/ b( T( y8 q" s: pBamHI Buffer          5ul
5 b& }7 N; ~7 m$ D$ Z/ ePCR product           ul
( R" V! c- B$ d' a# _  tBamHI               2.5ul
$ c* b, Q! ]/ v3 E: O9 A" A2 aHindIII               2.5ul  F/ z( G: W: l7 r: |, q
②: mix gently and spin down for a few minutes;" N' z) Y' N' H' N8 @$ n& ]5 T
③: incubate at 37°for 3hours7 V! f% l4 O; }$ k# e

刘森泉

通过酶切其他载体检测酶是否有问题；通过PCR检测载体是否有问题；第三就是酶切反应了，这样的体系一般没有问题，因为你的BamHI Buffer不适合切HindIII，至少单酶切可以成功，一条条带至少应该有。

风雪叶杰

酶切之后没有条带？建议先检测下酶的质量问题吧，还有buffer。就算切不开也不至于把片段弄没了，只有可能是降解了，这两个酶都挺好用 的，不会有什么大的星活性

b6122

/ v# M3 H& f5 H) E: f
% v% z8 H1 W6 v2 @6 X8 i3 Q
我切bamhi和hindiii的时候用的neb的buffer 2 （10x），我在网上搜了一下，配方如下：; E0 J( c  ]' O7 x2 Z& A: A4 Y6 G
1X NEBuffer 2:' I5 F, c  [, v' D  d* i2 ]3 ^
50 mM NaCl6 j4 U( n8 g# x% h- b
10 mM Tris-HCl3 Y, q" c) z, Y
10 mM MgCl2
* i$ P- r( p2 _# @7 |. O1 mM Dithiothreitol
! q7 @9 v3 s/ o* C; z6 _9 ^7 H- YpH 7.9 @ 25°C
  w: i1 J; n: g+ U这个buffer条件下，两种酶的活性都最高- q7 Z6 D+ X/ U* x5 |+ q

, `/ h/ l. s1 `4 i* i# {9 L另外，你pcr产物跑电泳后回收胶有没有问题？

daviddow

b6,你说的回收胶有什么问题？不知道什么意思？谢谢！我是沉淀了一下就酶切，没有跑胶。

daviddow

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" D2 |6 {3 e9 y9 a1 f& P( v0 p% Z: X; ~% a- k' }2 `/ t3 S
我的是fermentas公司的内切酶，这是他们推荐的内切酶。我切了质粒以后没问题，但是PCR酶切后就没有我需呀的条带了，都到了100bp一下了

daviddow

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1 J; W: ^. z. O9 m. F
1 s1 Q& C$ N9 s, n谢谢风雪，不知道哪些可以降解PCR产物？我的质粒没有问题，就是PCR产物都降解了

lazyworm

即使酶切没切开也应该有一条带吧，一点东西都没有要考虑前面的实验是否成功了。

youzi821

回复 daviddow 的帖子& R5 `( k0 `  [3 j3 O

) R) S7 p9 c/ [5 `fermentas的酶，你看下酶的最适孵育条件和时间，超过30分钟，BamHI有其它活性，最近我也遇到这个问题，把酶切时间缩短，如果是快速酶的话，15分钟左右就可以，不要孵育那么长时间。

youzi821

而且一般情况下双酶切需要用通用buffer，请按照你买的试剂公司的条件来做。