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作者：施永彦， 王家宁，张功礼，潘国栋，余永贵，邓长康作者单位：郧阳医学院附属人民医院1骨科，2临床医学研究所,湖北 十堰 442000 ' C3 l+ X6 v( k5 e
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: D D- y+ Z4 c3 h 【摘要】 目的:为使间充质干细胞（MSCs） 被绿色荧光蛋白（GFP）稳定标记，探讨通过逆转录病毒载体介导的GFP基因高效转染MSCs的方法，以便为研究在体干细胞分化奠定基础。方法:全骨髓法分离培养纯化大鼠MSCs，利用携带GFP基因的复制缺陷性逆转录病毒（Rt-GFP）转染MSCs，荧光显微镜观察GFP阳性的MSCs。结果:Rt-GFP 转染后，80%~90% MSCs可激发出明亮的绿色荧光，且荧光不随培养时间延长和传代次数增加而衰减。结论:Rt-GFP可以使MSCs获得长效稳定标记。
! d% ~& N8 ^$ o6 N# ` u$ u 【关键词】骨髓间充质干细胞
# s$ u# b- h# x; k5 L The labelling of mesenchymal stem cells mediated by recombinant replication-deficient retrovirus expressing green fluorescent proteinSHI Yong-yan1,3,WANG Jia-ning2,ZHANG Gong-li1, et al.(1Department of Orthopaedics, Renmin Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan, Hubei 442000, China； 3School of Medicine, Wuhan University, Wuhan, Hubei 430071)
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Abstract: Objective To obtain stable labelling of mesenchymal stem cells (MSCs) mediated by recombinant replication-deficient retroviral vector expressing green fluorescent protein (Rt-GFP) and provide a basis for in vivo differentiation study of MSCs in future. Methods Rat MSCs were cultured and purified with whole bone marrow method. The purified MSCs were infected with Rt-GFP. The GFP positive MSCs were observed with fluorescent microscopy. Results After Rt-GFP infection, 80%~90%MSCs were labelled by GFP. The fluorescent intensity of labelled MSCs was not changeable with the prolonged culture time and the increase of passage. Conclusion MSCs may be stably labelled by Rt-GFP.# c" ?2 D; M- T' Z- m, Q6 U
9 {# y% N8 k2 i+ v6 @2 [Key words： mesenchymal stem cells; green fluorescent protein; retroviral vector' c) z+ k4 C" k, {" F
( i/ y+ q) X6 t间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一种主要存在于骨髓中的间充质来源的多功能干细胞，可在移植的宿主损伤脊髓中存活，并向神经元和星形胶质细胞分化及向损伤部位迁移，有明显的树突生长，能分泌神经营养因子、细胞因子和其他生物活性因子，促进神经功能恢复，抑制不利于神经再生的瘢痕形成，降低死亡率。 MSCs作为一种独特的干细胞来源，用于治疗脊髓损伤具有非常重要的价值[1]。在深入研究细胞移植实验之前应考虑对移植细胞进行标记。目前常用4’,6二眯2苯基吲哚（DAPI）、5溴-2脱氧尿苷（Brdu）等进行标记，然而这种方法标记细胞的时限非常有限,随着移植时间的延长和细胞分裂次数的增加，标记物会逐渐减弱甚至消失，不利于移植细胞的跟踪和细胞分化的研究。本实验通过携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的复制缺陷性逆转录病毒（Rt-GFP）转染MSCs，以便使MSCs被长期、稳定地标记。
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* U% d9 l& j+ H" s. \9 s, y1材料和方法
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1.1MSCs培养和纯化
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2 h5 ~- O4 u- s% R5 \; T* d采用全骨髓法。取2月龄100~150 g Wistar大鼠（湖北省实验动物中心），腹腔注射肝素5 000 U，15 min后断颈处死，分离双侧胫股骨中全骨髓，按1106 细胞/ml接种于含15%新生牛血清（杭州四季青公司）的DMEM（GIBICO/BRL公司）培养基中，在37 ℃，5% CO2饱和湿度环境中培养。24 h换液以去除未贴壁的造血干细胞，此后每3~4 d换液1次，待贴壁的成纤维样细胞达到80%融合时1∶3传代。经2~3次传代获得形态均一的MSCs。
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1.2Rt-GFP条件培养基获取! c# f6 B, V7 J. W3 `9 a
4 A, y! {; b2 y( @( `, n携带GFP基因的GD13逆转录病毒包装细胞（GD13-GFP，郧阳医学院附属人民医院王家宁博士惠赠），按1105细胞/ml接种于含20%新生牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃，5% CO2饱和湿度环境中培养。待细胞70%~80%融合时，收集含病毒的条件培养基，同时将细胞1∶4传代或冻存。: u _0 d0 Y) [, u
/ h5 e4 ~! C' J( m W1 W5 u1.3Rt-GFP转染MSCs
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: t& Y `6 |: z1 V/ X' k' E; U取P1代MSCs，按1105细胞/ml接种，4 h后绝大多数细胞贴壁，换为含Rt-GFP的条件培养基，孵育48 h后换为普通完全培养基继续培养。荧光显微镜观察转染细胞是否发出绿色荧光，表达GFP的细胞命名为MSC-GFP。
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2结果; C, ?& \: Q2 C7 f
7 o6 C; \( A7 s2.1MSCs培养9 s$ ~0 V, A$ u I8 @$ H
! ~: K E7 L% W4 J* }5 ?由于造血干细胞不贴壁生长，经过数次换液，悬浮的造血干细胞逐渐被清除，贴壁MSCs呈现匀一梭形成纤维细胞样形态（图1）。呈集落生长，增殖迅速。原代MSCs潜伏期约2~4 d，对数生长期3~5 d，此后进入平台期。传代MSCs潜伏期较短，约1~2 d，对数生长约3~4 d，可连续传5~6 代。一般原代细胞4~5 d可传代，传代细胞2~3 d可再次传代。
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5 h5 l7 C0 `; O' v2 M2 E2.2Rt-GFP转染2 A& R8 l! V' `+ l7 \/ @# n1 \
A' O, u7 W4 O; |! G" T; R% _经Rt-GFP处理后，MSCs形态和增殖方式无明显变化。荧光显微镜下，80%~90% MSCs胞浆可见绿色荧光（图2），MSCs传代至P8，荧光仍无明显衰减。
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% S# L, F' w+ N3讨论
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本实验采用的全骨髓法具有能在体外大量培养MSCs，操作简便，细胞增殖快，培养周期短等优点，适合临床需要。近年随着全骨髓法不断改进，获得MSCs的纯度也不断提高[2]。* @* S% Z' ?: [5 K3 F
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细胞标记是细胞移植实验不可缺少的环节。目前常用的方法是将标记物DAPI或BrdU与被标记细胞的DNA结合，通过对DAPI或BrdU的检测来判断是否为标记细胞。然而这种方法标记细胞的时限非常有限。由于DNA的半保留复制，被标记细胞内的标记物含量不断被平分到子代细胞中，其显示强度将随细胞分裂而逐渐衰减，很快就不能被检测出(4周时大部分DAPI荧光明显衰减),无法满足长期实验的需要。而且利用BrdU标记的细胞需通过复杂的免疫组织化学分析，不利于直接观察。
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GFP是一种具有自发荧光的小分子蛋白[3]。荧光蛋白标记技术是近年来迅速发展的一种新型细胞示踪技术,具有易于检测、特异性强、可以实现活细胞观察等优势。逆转录病毒可以将GFP基因整合到被标记细胞的染色体中而获得稳定表达，使子代细胞获得与母代细胞一样的标记效果，实现细胞的长时效标记，这些标记细胞可以通过荧光显微镜直接观察，而不需要反映底物，更不需通过复杂的免疫组织化学分析观察，且被标记的细胞仍具有多向分化潜能，明显优于通过DAPI或BrdU的标记检测。5 U- T, J( h% p% Z0 I
4 E0 i+ h! @# J5 Z逆转录病毒免疫源性小，是体外基因转染的理想载体，只转染增殖期细胞，它具有将目的基因高效转染，并稳定表达的优点。因此，本实验选择传代次数较少的MSCs，较高的培养液血清浓度，在细胞融合程度较低时进行逆转录病毒转染，以保证转染时大多数细胞处于增殖状态。结果显示绝大多数MSCs转染成功，为将来进行细胞移植实验创造条件。
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总之，MSCs作为受体细胞，易于获取并能在体外大量培养繁殖，并成功的将目的基因GFP在体外直接导入靶细胞MSCs，并获得稳定、长期、大量表达标记，为下一步将MSCs移植到损伤脊髓中的体内实验提供了坚实的基础。
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【参考文献】- ?1 w) X9 X h( r# o1 A) s: a& p
[1] Lin JR,Guo KY,Li JQ,et al.In vitro culture of human bone marrow mesenchymal stem cell clonies and induced differentiation into neuron-like cells[J]. Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao,2003,23(3):251-253, 264.
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( s6 S% X' d& Y) e3 z7 j5 l5 I1 S [2] Kassem M.Mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential clinical applications[J].Cloning Stem Cells,2004,6(4):369-374.
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[3] Shimomura O.The discovery of aequorin and green fluorescent protein[J].J Microsc,2005, 217(1):1-15. / @, O( `# e' m# ^' u q1 \& h
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[4] 王鸿飞, Wang HF，郑连杰，等.基因治疗脊髓损伤的前瞻性探讨[J].中国临床康复，2003，7（26）：3 624－3 625. |
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发表于 2009-3-3 12:20
发表于 2015-6-3 11:27
