CD4 CD25high调节性T细胞在异基因造血干细胞移植后的重建及其与aGVHD的相关性 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:36 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：孙道萍  吴德沛  李彩霞  刘跃均  杨明珍  常伟荣  朱明清  岑建农  邱桥成作者单位：苏州大学附属第一医院血液科江苏省血液病研究所，苏州 215006

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      【摘要】  目的：研究CD4 CD25high调节性T细胞在异基因造血干细胞移植后的重建情况及其与aGVHD相关性。方法：应用流式细胞技术及实时定量PCR技术检测22例异基因造血干细胞移植物中及移植后不同时期外周血中CD4 CD25 T细胞和CD4 CD25highT细胞占CD4 T细胞的比例（CD4 CD25 /CD4 、CD4 CD25high/CD4 ）、CD4 CD25highT细胞与CD4 CD25 T细胞之比（CD4 CD25high/CD4 CD25 ）以及FOXP3基因的表达。结果：①aGVHD组移植物中CD4 CD25high/CD4 及CD4 CD25high/CD4 CD25 比例均显著低于无aGVHD组（P  r4 J! f1 B( D4 l+ _' e! ^/ D) W
      【关键词】CD4 CD25high调节性T细胞异基因造血干细胞移植急性移植物抗宿主病
   　　FOXP3Restoration of CD4 CD25high regulatory T cell after allogenic stem cell transplantation and its correlations with aGVHD) {  a8 F( u! O9 |% J/ h
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　　SUN DaoPing,WU DePei,LI CaiXia,LIU YueJun,YANG MingZhen,CHANG WeiRong,ZHU MingQing,CEN JianNong,QIU QiaoCheng. Department of Hemotology,the First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China
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　　［Abstract］Objective:To study the way to restore CD4 CD25high regulatory T cell after allogenic stem cell transplantation and its correlations with aGVHD.Methods:To detect the ratio of CD4 CD25 T cells and the CD4 CD25highT cells in CD4 T lymphocytes（CD4 CD25 /CD4 ,CD4 CD25high/CD4 ）,the CD4 CD25highT cell subpopulation ratio in CD4 CD25 T cells（CD4 CD25high/CD4 CD25 ）,and the expression of FOXP3 mRNA in the donor grafts and periperal blood frequently after transplantation with the flow cytometry and realtime PCR assays.Results:①CD4 CD25high/CD4  and CD4 CD25high/CD4 CD25  ratios in the donor grafts were significantly lower in the aGVHD group（P8 ~+ C- @: \! T5 o  ?1 @

［Key words］CD4 CD25high regulatory T cell；Allogenetic stem cell transplantation；aGVHD；FOXP3
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移植物抗宿主病（GVHD）是导致异基因造血干细胞移植（alloHSCT）后死亡的最重要的并发症之一，如何利用免疫系统内在的调节机制调节异基因免疫应答，控制GVHD的发生，是目前移植耐受研究的焦点［1］。调节性T细胞可通过“主动”的方式抑制免疫系统对自身和外来抗原的应答，在维持机体免疫耐受和免疫应答稳态方面具有非常重要的作用。CD4 CD25 调节性T细胞是目前研究最广泛的一群调节性T细胞。人类CD4 CD25 调节性T细胞主要存在于CD4 CD25high(高表达)细胞亚群中，叉状头/翅膀状螺旋转录因子（FOXP3）在其发育和功能发挥中起重要作用。多项动物实验及临床研究表明,CD4 CD25 调节性T细胞在移植后控制稳态增殖和GVHD的发生中发挥重要作用。移植后CD4 CD25 调节性T细胞重建的延迟及其与效应性T细胞比例的失衡可能是GVHD发生的重要原因之一［2］。& P( A* e; S  ?
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本研究通过动态监测移植后CD4 CD25highT细胞的比例及单个核细胞的FOXP3基因的表达，来分析CD4 CD25high调节性T细胞的早期重建情况及其影响因素，探讨其在诱导免疫耐受和维持免疫稳态中的作用。
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　　1材料与方法. ^0 K7 D; r. {2 Q

　　1.1研究对象
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　　自2006年2月～9月本院行异基因造血干细胞移植者22例，男16例，女6例，中位年龄38（21～56）岁。AML 8例，ALL 5例，CML 7例，MM转化的ALL 1例,恶性淋巴瘤增殖性疾病1例。其中行同胞全相合骨髓移植(BMT)者16例，行同胞全相合外周血造血干细胞移植(PBSCT)者2例，行无关供体全相合移植者4例。同胞全相合移植采用改良马利兰、环磷酰胺方案(BUCY)预处理，环孢菌素（CsA）短程氨甲碟呤（MTX）方案预防GVHD。无关供体移植在BUCY方案基础上加用抗淋巴细胞免疫球蛋白（ALG）预处理，以霉酚酸酯（MMF） CsA 短程MTX（无关供体）预防GVHD。GVHD的诊断和分级标准参照文献［3］。22例中有10例发生aGVHD，其中Ⅰ～Ⅱ度8例，Ⅲ～Ⅳ度2例，中位发生时间为27天（9～41天），应用甲基强的松龙及MTX治疗，难治性者加用FK506、抗CD25单抗及雷帕霉素等。10例aGVHD患者中除1例死于重度肝脏型aGVHD外，余均经治疗后好转，症状缓解平均时间为7天（3～28天）。另外设健康对照组10人，中位年龄37（24～ 65）岁。

　　1.2标本采集8 k! t/ z" W, b" X+ L; ]4 o

　　采集供体移植物（骨髓或外周血）及患者移植后不同时期（移植后2周、4周、5周、2月、3月、6月）外周血2～6 ml，采集对照组外周血2 ml，EDTA抗凝。! o, r, e' |8 E- Z6 v% z; T: b
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　　1.3流式细胞仪检测

　　采用微量全血法及免疫双标法检测CD4 CD25 及CD4 CD25highT细胞亚群在CD4 T细胞中的比例。检测管加入CD4FITC及CD25PE各20 μl，对照管加入鼠抗人IgGFITC及IgGPE（单抗均购自Ebioscience公司）各20 μl，各管再加入100 μl外周血或50 μl骨髓，避光孵育20分钟，溶血10分钟后PBS洗涤2次，最后以500 μl PBS重悬，流式细胞仪（Backman Coulter）检测。CD25高表达是以CD4-T细胞群体CD25的表达水平为参照。$ I+ {. [( Z/ y, b& e6 n& p4 p4 @
2 u4 K9 R% e5 S$ r
　　1.4实时定量PCR检测单个核细胞FOXP3基因的表达; i6 v7 D, I+ w  }* k

　　1.4.1标本准备

　　Ficoll分离外周血或骨髓后获得单个核细胞，加入Trizol 1 ml进行RNA提取，取总RNA 2 μl进行逆转录反应合成cDNA，-20℃保存备用。& r2 K  O3 K$ Q" y5 w3 O
$ m5 |; w4 Q- L, {" @
　　1.4.2标准品制备. ?9 S: B2 I9 {) x

　　将FOXP3基因及GAPDH基因的PCR扩增产物克隆入T载体,扩增纯化重组载体，测序鉴定,并将其定量(上海英俊生物公司);最后从108拷贝/μl开始进行10倍稀释建立阳性模板梯度，-20℃储存备用。7 r4 {9 P3 G2 j

　　1.4.3荧光定量PCR检测FOXP3 mRNA相对含量
8 Z+ O7 a3 E5 a1 U
　　采用下列引物：FOXP3上游引物5′CAG CAC ATT CCC AGA GTT CCT C3′，下游引物5′GCG TGT GAA CCA GTG GTA GAT C3′；GAPDH上游引物5′GGA AGG TGA AGG TCG GAG TC3′；下游引物5′CAT TCT CAG CCT TGA CGG T3′，采用Taqman荧光探针：FOXP3 5′FAMTCC AGA GAA GCA GCG GAC ACT CAA TGTAMRA3′及GAPDH 5′FAMTTT GGT CGT ATT GGG CGC CTGTAMRA3′。采用25 μl反应体系，含5 μl 5Buffer、0.2 μl MgCl2（250 mmol/L）、0.75 μl dNTPs（10 mmol/L）、0.5 μl引物（10 mmol/L）、0.3 μl探针（10 mmol/L）、0.25 μl Taq酶和2 μl cDNA。反应在PE5700扩增仪上进行，94℃ 5分钟后，94℃ 15秒、60℃ 1分钟，共50个循环。每次检测均以标准品制作标准曲线，r2=0.997。FOXP3转录本的值以相对量表示（FOXP3拷贝数/GAPDH拷贝数106）。! @3 y: j' o$ m# z; J6 q% y$ K
4 W5 s5 G% V6 M+ m' y) D
　　1.5数据分析

　　所得数据以x±s表示，使用SPSS 11.5统计软件对流式结果进行两样本t检验分析，对PCR定量结果进行MannWhitney U检验进行分析，以P2 J0 u# C. f: z' r2 g) A
: A- I1 y$ @9 n0 B. l" ]7 Y* u9 Y4 |
　　2结果
. D0 z& h) c* }1 v2 Q% k# ]
　　2.1无aGVHD组移植后CD4 CD25high调节性T细胞的重建情况: t  H6 Y& o' [" \1 M" q
( O0 d; U  [3 A0 ?/ U
　　2.1.1移植后CD4 CD25 T细胞与CD4 T细胞的比例、CD4 CD25highT细胞与CD4 T细胞的比例以及CD4 CD25highT细胞与CD4 CD25 T细胞的比例的动态变化) L, Z6 D' ?, _5 F

　　见图1～图3。人类CD4 CD25 T细胞实际包括调节性T细胞（CD25high）和效应性T细胞（CD25int中表达）两群，因而本研究对CD4 CD25 T细胞和CD4 CD25highT细胞的比例分别检测，并进一步分析CD4 CD25high与CD4 CD25 的比值，该比值可在一定程度上反映CD4 调节性T细胞与活化的效应性T细胞的比例［4］。结果发现，①无aGVHD组CD4 CD25 /CD4 比例在移植后2周时较移植物中者显著升高（P% [9 y# [, H* [! a
: Y; p, o9 T1 F: @( c! }5 k+ |1 j
　　2.1.2移植后单个核细胞FOXP3基因表达的动态变化  J( H7 A) `1 ^( d8 Q) N( e
2 b: Z  Q# x& N6 e% d3 c  P. m7 [
　　见图4。无aGVHD组FOXP3的表达水平在移植物中最低（P

　　2.2aGVHD组移植后CD4 CD25high调节性T细胞的重建情况
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　　2.2.1移植后CD4 CD25 T细胞与CD4 T细胞的比例、CD4 CD25highT细胞与CD4 T细胞的比例以及CD4 CD25highT细胞与CD4 CD25 T细胞的比例的动态变化# _) |  C7 U0 z9 o/ l
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　　①aGVHD组移植后CD4 CD25 T细胞的比例的变化趋势与无aGVHD组相似，移植后2周时CD4 CD25 T细胞的比例较移植物中显著升高（P=0.003），移植后1个月及5周时下降。然而与无aGVHD组不同的是，该比例在移植后2个月时又有显著升高（P=0.022），且显著高于健康对照组（P=0.001），这可能与CD4 CD25 T细胞活化和增殖参与aGVHD的发生有关，见图1；②aGVHD组移植后外周血中CD4 CD25highT细胞的比例变化趋势亦与无aGVHD组类似，即早期比例较高，后逐渐降低。但aGVHD组移植物中的CD4 CD25highT细胞的比例较低，显著低于无aGVHD组（P=0.01），而移植后2周时较移植物中者显著升高（P  b7 e' P# _! v3 s$ q# V8 R
4 V3 h. ^8 Z# F# [
　　2.2.2单个核细胞FOXP3基因表达的动态变化9 w/ Q) m" Q) O5 y; O

　　见图4。aGVHD组移植后外周血FOXP3的表达水平亦逐渐升高，但低于无aGVHD组，尤在移植后2～3月时有显著差异（P=0.002），提示移植后aGVHD组CD4 CD25high调节性T细胞的数量或FOXP3的表达低于无aGVHD组。
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　　3讨论2 F+ p6 H) e5 @2 w; J' [' P
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移植后免疫重建不仅仅是各免疫系统组成成分（如免疫细胞、免疫器官及细胞因子等）的数量和功能的恢复，更重要的是免疫稳态的重建。T细胞是一个复杂的群体，既包括幼稚T细胞、效应性/记忆性T细胞，又包括调节性T细胞；既包括具有抗感染及肿瘤特异性的T细胞，亦包括自身反应性的T细胞。移植后这些T细胞亚群数量和功能恢复及相互间平衡的维持对重建免疫稳态，控制GVHD具有重要意义。目前研究发现CD4 CD25high调节性T细胞在控制异基因免疫应答，诱导移植免疫耐受中发挥重要作用，CD4 CD25high调节性T细胞与效应性T细胞间的失衡可能是导致GVHD发生的重要环节［2］。& v% J( s2 O, e+ [8 F3 U% u4 m2 q
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移植后早期受组织相容性抗原的差异、受体内淋巴细胞重度减少的环境、广泛性组织损伤和大量炎症因子的释放以及病原体感染等因素的影响，受体内的免疫稳态被打破。供体源性的淋巴细胞发生较强的活化和增殖，在介导抗感染和抗肿瘤免疫应答的同时，亦可产生针对受体正常组织的破坏性免疫反应即产生GVHD。本研究监测无aGVHD组移植后早期外周血中CD4 CD25 T细胞的比例即发现，其在移植后2周时比例显著升高，而移植后1个月后逐渐降低，从而提示CD4 效应性T细胞在移植后早期发生了活化和增殖。而在此过程中，CD4 CD25high调节性T细胞的比例的变化趋势与之类似，且移植后早期CD4 CD25high调节性T细胞与CD4 CD25 T细胞的比例显著高于健康对照组；FOXP3的表达亦在移植后前1个月内显著升高。这说明CD4 CD25high调节性T细胞亦在移植后早期CD4 效应性T细胞活化和增殖的同时诱导产生、活化和增殖，从而有助于限制非调节性T细胞的过度免疫反应，维持效应性T细胞和调节性T细胞间的动态平衡，是控制aGVHD发生的重要机制。近来Vanasek等［5］亦通过动物实验模型证明了CD4 CD25 调节性T细胞在淋巴细胞减少的环境中伴随CD4 反应性T细胞同时产生，对控制CD4 反应性T细胞的免疫应答和维持免疫耐受发挥重要作用。
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在移植后早期，CD4 CD25high调节性T细胞同传统淋巴细胞一样主要来源为供体源性CD4 CD25high调节性T细胞的外周扩增，以及在异基因免疫应答、抗感染免疫应答等中诱导产生。移植物中CD4 CD25high调节性T细胞的数量和比例可能影响移植后CD4 CD25high调节性T细胞的早期重建，从而影响免疫稳态的建立。动物研究发现，提高移植物中CD4 CD25 调节性T细胞的比例或过继输注CD4 CD25 调节性T细胞均可控制GVHD的发生［6］。近来Rezvani等［7］在临床研究中发现，移植物中CD4 FOXP3 调节性T细胞的数量与Ⅱ～Ⅳ度aGVHD呈负相关。本研究也发现，aGVHD组移植物中CD4 CD25high调节性T细胞的比例及其与活化的CD4 效应性T细胞的比例显著低于无aGVHD组。由此揭示，供体来源的CD4 CD25high调节性T细胞在移植后控制GVHD和维持免疫稳态中发挥重要作用，该作用可能是CD4 CD25high调节性T细胞通过识别异基因抗原而介导的，而这种作用的发挥并不受MHC差异的限制［8］。( K) N' K4 r9 x: B3 w+ t

另外，异基因免疫应答亦是影响CD4 CD25high调节性T细胞的早期重建的重要因素。我们比较aGVHD组及无aGVHD组移植后CD4 CD25high调节性T细胞的重建情况发现，aGVHD组外周血中CD4 CD25high调节性T细胞的比例及其与活化的CD4 效应性T细胞的比例在移植后早期均显著升高，而在无aGVHD组两者无显著升高，且低于aGVHD组。因此可认为，尽管aGVHD组移植物中CD4 CD25high调节性T细胞的比例低于无aGVHD组，但在移植后早期免疫应答及aGVHD的影响下，该组的CD4 CD25high调节性T细胞可发生更为显著的活化和增殖，并优先于CD4 效应性T细胞，以控制其过度活化和增殖，这可能是机体免疫调节重要机制之一。然而本研究还发现，移植后两组的FOXP3的表达均逐渐升高，但aGVHD组FOXP3的表达低于无aGVHD组，提示aGVHD组中外周血CD4 CD25high调节性T细胞的数量或FOXP3的表达较低。这可能与aGVHD组移植后早期受体内更强的“炎症风暴”、免疫抑制剂的应用以及胸腺的损伤影响了CD4 CD25high调节性T细胞的数量和功能有关，而这正是导致aGVHD发病的重要因素［2，9，10］。Miura等［11］也发现在未发生GVHD的患者外周血单个核细胞FOXP3的表达水平随移植时间逐渐增加，但在cGVHD的患者持续表达较低。可以认为，CD4 CD25high调节性T细胞的重建障碍与GVHD的发生是相互影响、互为因果的。目前，通过输注体外扩增的CD4 CD25high调节性T细胞，尤其是受体抗原特异性的CD4 CD25high调节性T细胞，以及使用IL2及雷帕霉素等免疫调节剂来促进CD4 CD25high调节性T细胞的重建均显示出了控制GVHD的有效性，具有一定的临床应用前景［1214］。

总之，移植后早期CD4 CD25high调节性T细胞发生活化和增殖，是机体维持免疫稳态、控制aGVHD发生的重要机制。CD4 CD25high调节性T细胞的重建障碍与aGVHD的发生密切相关。进一步研究CD4 CD25high调节性T细胞的重建及其与GVHD的相关性，将有助于理解aGVHD的发生机制，并为aGVHD的治疗提供新的策略。+ F$ E  J9 B0 S
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