干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 分离单核细胞离心多少转速？ [打印本页]

作者: lily132 时间: 2016-7-29 09:53 标题: 分离单核细胞离心多少转速？

大家从血里分离单核细胞，最后洗剂时离心用多大转速呢？我用2000转5分钟，计数时发现有好多死细胞，不知道死的是红细胞还是单核细胞。

作者: swtarron 时间: 2016-7-29 10:13

关于离心参数最好用离心力表示，不然相同的转速，，相同的离心时间，不同的离心机由于转子半径不同，会有不同的离心效果。我们是用的250g/6 min，可作参考。

作者: 千细胞 时间: 2016-7-29 10:21

材料来源干细胞之家---《人类血液来源免疫细胞库建设与管理规范》
$ Y+ D5 E: h* b3 u

附录 C （资料性附录）2 L G+ o [, C( q
PBMC制备步骤8 k" _* s& a& ~0 z
PBMC的制备步骤见以下：4 @; ~8 f0 c5 c
1) 将血袋中的血转移到离心管中，使用经灭菌消毒的剪刀剪断塑料管，小心把袋中的外周血倾倒入离心管中，将外周血袋热合封口。6 p/ }, i* X( g: m, \
2) 离心分离出血浆，2000rpm，10min，室温离心。5 N" i% @' ]8 U
3) 离心完毕后分层，吸取上层血浆层到离心管中，贴上血浆编码标记暂于4℃保存。
4) 下层血细胞稀释：用生理盐水按1:1的比例稀释血细胞，混匀。
5) 铺层加样：将稀释的血液样本缓慢匀速的加入到盛有室温的淋巴细胞分离液上方，两者比例约为1:1，铺层的整个过程都应注意不能打破淋巴分离液与血液样本的分界面。离心：2000rpm，20min，室温,慢升慢降。
6) 提取单个核细胞: 离心完毕后，离心管内出现明显分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、ficoll层、单个核细胞层、血浆生理盐水层。吸取血浆生理盐水层弃之，直至距白膜层5mm处，小心将红细胞层之上的白膜层转移至50ml离心管中，补充生理盐水，细胞悬液与生理盐水比例大于1:3，混匀。9 Q8 Z* M |/ S4 d* }- N( y( }1 P( a
7) 离心：2000rpm，10min，室温。
8) 离心完毕后弃掉上清液，用40ml生理盐水重悬细胞沉淀，混匀，取0.5ml混匀悬液计数。离心：1500rpm，10min。
9) 离心完毕后收集上清液留作无菌检测，细胞沉淀即为目的细胞。
10) 以《中国药典》、《中国GMP实施指南》等为指导，针对前体细胞-外周血单个核细胞（PBMC）的分离、冻存、表型鉴定和功能检测等过程。

作者: 生物太次郎87 时间: 2016-8-1 08:27

我的天呐，最后洗涤用这么高的离心转速，单个核细胞都送上了黄泉路了，我们是1500rpm、10min、升9降7。是为了洗去血小板。假如一次FICOLL离心效果不佳，可以再离心一下，最后一次900rpm、10min、升9降7。有疑问可以再交流。

作者: HelenMalus 时间: 2016-8-1 09:35

我们最后洗涤用的是1500rpm升9降7离心8min，单个核细胞离心转速不能那么大

作者: 我是传奇 时间: 2016-8-1 09:42

2000转洗肯定会死，一般1200-1500，根据红细胞数量调整。

作者: baby00000003 时间: 2016-8-1 14:51

不能超过800g，一般离心全血这一类的粘稠细胞悬液最大800g，比如50ml一管，就800g＊20mins可以了( G D4 K# w7 I9 z, q' d9 m
比较稀的细胞悬液，比如培养完以后收获，400g＊10mins足足够用了

作者: chenguangyu 时间: 2016-8-9 17:09

300g 8min or 400g6min

作者: qinchuanniu 时间: 2016-8-10 08:55

PBMC制备步骤
PBMC的制备步骤见以下：) D0 @& w* E  v. y4 |
1) 将血袋中的血转移到离心管中，使用经灭菌消毒的剪刀剪断塑料管，小心把袋中的外周血倾倒入离心管中，将外周血袋热合封口。, N: ^; O8 }- f) j" B* H" X. B" D  X/ D
2) 离心分离出血浆，2000rpm，10min，室温离心。) ~" {# |' a$ {' Z2 B/ [5 z4 c+ Z1 K, W" |
3) 离心完毕后分层，吸取上层血浆层到离心管中，贴上血浆编码标记暂于4℃保存。
4) 下层血细胞稀释：用生理盐水按1:1的比例稀释血细胞，混匀。! v0 h+ V( w" V8 ]
5) 铺层加样：将稀释的血液样本缓慢匀速的加入到盛有室温的淋巴细胞分离液上方，两者比例约为1:1，铺层的整个过程都应注意不能打破淋巴分离液与血液样本的分界面。离心：2000rpm，20min，室温,慢升慢降。
6) 提取单个核细胞: 离心完毕后，离心管内出现明显分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、ficoll层、单个核细胞层、血浆生理盐水层。吸取血浆生理盐水层弃之，直至距白膜层5mm处，小心将红细胞层之上的白膜层转移至50ml离心管中，补充生理盐水，细胞悬液与生理盐水比例大于1:3，混匀。4 Q: p$ }' ~/ m! R  s& q3 R( j. @+ M# }! o% S; z
7) 离心：2000rpm，10min，室温。% h9 ^0 {) l. i5 ~+ m' f% {7 E( A2 v* R& `! Q+ B
8) 离心完毕后弃掉上清液，用40ml生理盐水重悬细胞沉淀，混匀，取0.5ml混匀悬液计数。离心：1500rpm，10min。
9) 离心完毕后收集上清液留作无菌检测，细胞沉淀即为目的细胞。
10) 以《中国药典》、《中国GMP实施指南》等为指导，针对前体细胞-外周血单个核细胞（PBMC）的分离、冻存、表型鉴定和功能检测等过程。

作者: qinchuanniu 时间: 2016-8-10 08:57

1. 分离血浆，1800rpm/min,15min& {+ _! `3 M! ]1 M( v. K
2. 吸取上层血浆，56℃、30min- F8 i$ A: ?* E6 j
3. 下层血细胞，生理盐水1倍稀释，人淋巴细胞分离液分离，2100rpm/min,20min9 `) A! L( K3 n$ x% C7 y7 |6 o
4. 吸取白膜层，生理盐水洗2次，1800rpm/min,15min0 ]& d2 I$ p3 p9 x3 f+ h. O
5. 细胞计数，加入培养基，CO2培养箱培养 T, W+ d5 w* Y

作者: Liyun65 时间: 2016-8-10 09:34

每个离心机转速和离心力是不一样的，你最好看看你用的离心机的离心力，你的离心转速是有点太高了，我们用的是400g,4min。细胞状态还挺好的，就是血小板有点多，也在考虑要不要把离心力再降低一点。

作者: LVXUEYAN1101 时间: 2016-8-30 16:17

分离单个核细胞用2000rpm/min,20min，最后洗涤1000rpm/min,10min，主要是为了洗涤血小板

作者: 叶未落 时间: 2016-9-1 09:29

本帖最后由叶未落于 2016-9-1 09:29 编辑
. T! ]7 B6 ]: j) l9 Q- e! M: @  k# V
1.    分离血浆，红细胞沉降  460rpm/min,5min5 N1 E, [; l' I2 b
2.       吸取上层血浆离心 1700pm/min,5min1 J9 Y3 P2 @5 L! O: N% G/ E
3.       下层血细胞，生理盐水1倍稀释，离心 1600pm/min,5min

作者: lccsiais 时间: 2016-9-1 16:42

分过一次健康人PBMC的单个核细胞，离心条件是250G，15min，白膜层很清晰。: d5 T9 m* t/ z+ w2 n( [% ~
就一般情况下的离心洗涤等，淋巴细胞虽然离心力高点，但也不要超过400G。

作者: 冯君朝 时间: 2016-9-2 07:32

1800rpm，升9降7，10min，

作者: kaiyou 时间: 2016-9-3 22:59

800g 15分钟。
速度一定要慢升慢减，否则分离效果不佳。

作者: 免疫与细胞 时间: 2016-9-4 09:32

我们关注的重点应该是离心力，并不是转速。离心机转子的半径不同，在相同转速下所产生的离心力也不同。因此不要用转速来表示，可以查查公式，换算一下，一般离心力不可以超过800g。国内外的文献上都有。

作者: quanquan326 时间: 2016-10-11 13:49

800g 15分钟。

作者: quanquan326 时间: 2016-10-11 13:49

800g 15分钟。+ c, E4 B3 [9 S7 |$ _) g- ]

作者: quanquan326 时间: 2016-10-11 13:49

800g 15分钟。; Y( o7 C5 _$ O* C' K" q* L

作者: LVXUEYAN1101 时间: 2016-10-11 14:40

最后洗涤一般用1000rpm/min,10min，主要目的是洗去血小板，一般分离出来离心速度都是逐渐下降洗涤的

作者: 细胞之家 时间: 2016-10-17 16:50

1.分离血浆：700g，10分钟! |- Z# n/ l6 t, e R: r% E
2.洗涤：500g，8分钟

作者: sky512829 时间: 2016-10-20 12:49

每台离心机转速不一样离心力不一样。但是分离细胞需要离心力不大800g就可以了，时间一般15到20分钟，你们说的升9降7是快升快降了，按道理应该是慢升慢降，设置为0，洗涤的话500g足够，5到10分钟

作者: ccfc 时间: 2016-11-2 09:29

我们用的是50ml离心管，2000rpm，5min离心

作者: zhangjieyctc 时间: 2016-11-8 16:57

回复 qinchuanniu 的帖子" y9 {3 q* y8 v( r3 Y- i; ^$ q# l
8 `4 T4 G9 i: y* j$ _- \
你好，一般用什么培养基培养单核细胞

作者: aochongyu 时间: 2016-11-9 09:02

我们一般都是4oog，5min，离心力比转速要准确吧

作者: 阳光斑点 时间: 2016-11-10 15:13

回复 aochongyu 的帖子 J7 k2 W# T' O! k9 ]1 ]
' Z2 {, u- w+ B* ~
我们这边分离单个核时，用的是700g，20min，升3降3，之后洗涤两次，800g，10min，300g，8min，主要是洗去里面混有的血小板。

作者: ltickp 时间: 2016-11-21 11:51

2000转5分钟，血液不同，活率不同，计数前可以破红看看，4%冰醋酸破红后再计数，个人感觉准些

作者: xieyun20052005 时间: 2016-11-27 11:28

洗涤1300rpm,7min或者1500rpm,5min

作者: wjh四月 时间: 2017-3-21 15:17

Thermo的离心机，800g，离心20min，升6降4

作者: shy-shen 时间: 2017-3-22 09:01

回复 lily132 的帖子
' p4 E7 j0 \: } p" M
直接先加ficoll，后加血，如果想效果好的话就多加点ficoll，按1：1加入，800g 20 min 升9降1，清洗的话就1800或1700 5min，吸取白膜层是少吸点ficoll，不然会影响离心

作者: liuyunmeng2002 时间: 2017-3-24 13:53

400g，5-10min

作者: 免疫与细胞 时间: 2017-3-27 15:24

光说转速没用的，得看离心力，不要超过1000g。

作者: 18911772023 时间: 2020-5-21 08:17

500g 10min

作者: 海北 时间: 2020-12-15 14:49

回复 lily132 的帖子
* O# m( p& c/ o* W5 p; Z
1200G,20MIN。每个实验室的离心机不一样离心力不同，可根据此离心力结合实验室离心机调整

作者: jinhaifeng 时间: 2021-12-9 08:47

400g，5min足够了，单核细胞的离心力不能太大，离心力太大容易有损伤影响后期实验

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)