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标题: 急求如何从病人的尿液样本中分离，提取尿液上皮细胞的protocol [打印本页]

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作者: innatestem    时间: 2017-2-15 21:55     标题: 急求如何从病人的尿液样本中分离，提取尿液上皮细胞的protocol

各位大侠们，小弟急需如何从病人的尿液样本分离，提取尿液上皮细胞额实验流程。感激不尽哈~~~
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作者: lchanlon    时间: 2017-2-16 06:07

回复 innatestem 的帖子9 c  S0 w: u6 u" G# R4 C
) F; v0 x# e% @  c) @
This paper is talking about how to isolate epithelial cells from urine samples and to generate iPSCs from these epithelial cells. Hope it can help.

附件: Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. .pdf (2017-2-16 06:07, 1.45 MB) / 下载次数 0
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=ODM5MjN8ZTM2MDc5ZWZ8MTcxNDYzOTM1OXww

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作者: innatestem    时间: 2017-2-16 10:09

回复 lchanlon 的帖子
- X9 p) k: l4 z& Z% z
4 s1 R7 G) G, t( P& k0 R谢谢你的分享~

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作者: niliu730323143    时间: 2017-2-16 16:47

1.     收集尿液，1000ml左右，当天收集当天离心收集。# J4 S; Z6 Q, d2 v$ s
2.        1010g离心4min；用多支50ml离心管离心。
% J+ k  |* |8 i- Q' h  @3.        小心吸掉上清，剩约0.3-0.5ml液体。所有离心管合并一管。
3 s4 _' Q* x# O! {6 L3 s) y( R  G  h4.     1010g离心4min，用包含PS的PBS洗2次。
$ c5 d  _' p: |5.     加培养基重悬，种到0.1%gelatin包被的48孔板上。9 F! G3 J  m+ [- W1 }5 x
重点是培养基！！！（纯技术交流，参考着看）

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作者: 时一清    时间: 2017-2-16 17:13

1、在无菌 250ml 离心瓶内加双抗 5ml,  4℃。 + R% |" w( e* }
2、中段尿液 150-500ml,  4℃。 1 A! l( f; I& G( ?# O
3、将尿液分装于 50ml 离心管中，400g 离心 10 min; 弃上清，底部预留约 2-3ml液体; 将上述尿液细胞液体合并为 1 管。 ! a5 m9 p8 I( L# ]
4、加入 PBS 至 50ml (双抗, 2x)，400 g 离心 10 min , 用 PBS 洗涤 1 次；用 3ml 尿液细胞培养基 (双抗)，重悬细胞接种于预先明胶铺被的 6 孔板。
) f9 x7 y& n1 H  q+ A5、静置 3 天后观察是否有尿液细胞克隆形成（克隆 3~6 天可形成，也可能超过 6天。克隆形成后 1 周~10 天可长满培养皿，根据细胞状态也可能需要更长时间）。当克 隆形成较多后，每两天更换培养基 1 次；根据实验需要培养、冻存及传代（0.25% 胰酶消化 2~3 分钟，37℃，加入饲养层细胞培养基终止消化）。
7 F7 {9 x- Y: S/ y

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作者: 时一清    时间: 2017-2-16 17:13

健康人尿液中细胞很少~成功率不高

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作者: 淘知路遥    时间: 2017-2-20 12:14

正常尿液中经过尿道排出来带有各种菌，成功率低，何况是病人，特别是尿道感染的。

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作者: 淘知路遥    时间: 2017-2-20 12:16

医院有种方法可以暂时使保持私处保持干净无菌，然后再取尿液应该更好些

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作者: innatestem    时间: 2017-2-21 08:53

回复 innatestem 的帖子
9 m0 u' q! v* z3 G% A  i5 S; i$ F, _. J& t' s2 n1 G4 m  T
你好。谢谢你的分享，培养基的成分有哪些？你能分享一下吗

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作者: innatestem    时间: 2017-2-21 08:55

回复 时一清 的帖子- @8 w$ b3 \7 Q$ A1 @

; y/ M* D' z7 H你好。谢谢你的分享，培养基的成分有哪些？你能分享一下吗
9 F, n% e* m1 j. g, r; M; a! _# {

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作者: innatestem    时间: 2017-2-21 08:55

回复 niliu730323143 的帖子% V. H% L8 \1 \" l4 P

! [1 m% T+ j/ r7 Z: v# @2 `你好。谢谢你的分享，培养基的成分有哪些？你能分享一下吗; |" N2 A5 d# ]. J% [

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作者: 时一清    时间: 2017-2-21 16:31

Primary Medium： 5ml FBS，250μl P-S，100μl amphotericin B，REGM SingleQuot kit 每管 50μl，再 加入 DMEM/high glucose 和 Ham’s F12 nutrient 等量混合液加至总 50μl。 注：Store the medium in the dark at 4 °C and use it within 2 weeks.
  w% w7 c3 T* w( F% G: G  [9 BRE Proliferation Medium： 50ml REBM 培养基中加入 REGM SingleQuot kit 每管 50μl。 * S1 M: w6 c5 ?5 M; A2 t/ |! c8 J
注：Store the medium in the dark at 4 °C and use it within 2 weeks.
. K! n$ Q0 V  p/ S1 l% n4 Z5 B6 u8 `7 L; Z% M  z, s
建议你仔细看一下
2 q/ [' O6 U" _8 F/ p* P: S$ d  \Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.

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作者: niliu730323143    时间: 2017-2-22 17:30


* O3 ^* @( g3 v& k
7 r- m1 E! w5 _  q% K回复 innatestem 的帖子
9 P4 y1 U% m# P
6 e3 U( q" `- n9 K. m% K3 ]& _The;primary;urine;cells;were;then;processed;and;cultured;in;urine;cell;medium;consisting;of;a;1:1;mixture;of;DMEM/F12;culture;medium;supplemented;with;10%;of;FBS;(FBS,;PAA),;0.1;mM;non-essential;amino;acids;(NEAA),;;1;mM;GlutaMAX;(Life;Technologies),;0.1;mM;β-mercaptoethanol;and;SingleQuot;Kit;CC-4127;REGM;(Lonza).
, J) ^& D, o% U% {- Z+ [# V0 o
7 N$ Y: l2 A% ?2 O) _参考文献：Generation of integration-free neural progenitor cells from cells in human urine。

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