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标题: 求助成年小鼠SVZ取材详细步骤 [打印本页]

作者: yhy313 时间: 2010-5-19 15:06 标题: 求助成年小鼠SVZ取材详细步骤

成年小鼠SVZ取材及原代培养的详细步骤。谢谢！
( `& [. K0 e9 Q* X2 ]
以下是从第三军医大博士毕业论文上摘下来的，请各路高手指导，看是否需要改进，主要是想在SVZ取材方面获取指导，非常感谢！$ K9 ~$ B5 b( d
1．取8周龄C57雄性小鼠，腹腔麻醉。" h" x5 u% N1 w& i0 W' F
2．头部70％酒精消毒。
3．剪刀从颈部断离头部，剪开头皮、颅骨，取出大脑，置于盛有冰的无菌D’Hanks的小皿中。
4．去除血迹，放入另一盛有冰的无菌D’Hanks的小皿中，去除脑膜，在显微镜下操作。! K% R! @$ b/ j+ J' M. Z
5．将大脑约1／2处横断，保留前脑(近嗅球端)，沿中线分为两半。7 R2 w D m7 \/ A: T/ i9 V5 c
6．将半脑外侧面朝下，用一只镊子固定，另一只镊子去除剩余的海马、SVZ内侧壁，见SVZ外侧壁呈月牙型，上下侧与白质相连，界限清晰。
7．分离之，去除四周的白质纤维。取出置于无菌的1．5毫升Eppendorf离心管中，置于冰中。5 W& \$ }8 I; O4 M
8．同样分离另一侧的。
9．每个离心管中加入400ul的0.1％含EDTA的胰酶。 y' k" r8 \2 K6 h- k! Y
10．轻柔吹打5～10次，将组织吹打成细块状(使用1000ul的蓝色枪头)。
11． 37℃孵育10分钟。每个样本组织再轻柔吹打(用2001xl的枪头)约20次，使得SVZ组织消化成小的颗粒。- v* s" ~' u6 m) B
12． 37℃再次孵育10分钟，再轻柔吹打(用2001xl的枪头)约20次，使得SVZ组织完全消化成单个细胞。% S' D$ s- p: `/ I( ]
13．可以酌情延长消化时间和次数，最终使得组织完全消化成单个细胞。
14．每个离心管中加入4001xl的NSCs培养基终止消化。
15．常温下O.3 rcf离心3分钟。
16．去上清，加入培养基洗涤一次，再次0．3 rcf离心3分钟。
17．去上清，加入培养基轻柔的重悬细胞。: e/ n5 H% h3 v& e% F
18．移入50ml的培养瓶中培养，每瓶加约10ml培养基（培养基为DMEM/F12(1:1)，每50ml中添加了青霉素．链霉素500微升，N2 500ul， B27 1ml，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ng/ml，表皮生长因子(EGF)20ng/ml）。约7～8天后神经球形成。
19．将培养瓶放置在倒置显微镜下进行神经球计数。5 V. _, j3 W1 K0 J
20．在24小时后换液一次，换出死细胞和其它杂质。$ S4 {1 q& s" P7 E+ t
21．观察到神经球长到约200um大小时即可传代。

作者: iseeyou1210 时间: 2010-5-19 18:11

very good!

作者: yhy313 时间: 2010-5-20 22:59

另一种取材方法：3 P3 K. v# u! N5 B
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作者: ambassador 时间: 2010-5-21 14:38

我来补充一下SVZ神经干细胞的知识吧！
附上这篇第三军医大学2003年发的：3 {* }( t1 A7 M& v" I
SVZ神经干细胞和祖细胞" t+ D' i* A- g
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作者: beidouhan 时间: 2010-6-12 13:19

不错的分享

作者: smkx 时间: 2010-8-18 20:54

谢谢

作者: mumudan 时间: 2010-8-18 23:25

请问楼主，你每次分离的时候都能看到明显的透明条带吗？能很准确的取到那个区域吗？我最近也在取，貌似方法不是很好，可否交流下！

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