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标题: 具有高效种系嵌合能力的129ter小鼠胚胎干细胞系GLDD-1的建立 [打印本页]

作者: 文献管理员 时间: 2009-3-3 12:21 标题: 具有高效种系嵌合能力的129ter小鼠胚胎干细胞系GLDD-1的建立

作者：侯宁程萱孙彦洵程竞杨晓

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      【关键词】胚胎干细胞
   【摘要】目的建立具有高效种系嵌合能力的小鼠胚胎干细胞（ES细胞）系。方法收集129/ter小鼠3.5天的囊胚，用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层，经过4～6天的培养，离散明显增殖的内细胞团（ICM），经2次亚克隆纯化后，获得稳定传代的胚胎干细胞系。对获得的胚胎干细胞系进行核型分析，选择XY型胚胎干细胞进行显微注射，对小鼠胚胎干细胞整合进生殖系的能力进行分析。结果获得了4株（GLDD-1-4）能够稳定传代的小鼠胚胎干细胞系。4株细胞系的核型正常率均>70%，其中GLDD-1、GLDD-2为XY型。通过囊胚显微注射法，将GLDD-1、GLDD-2ES细胞注入C57BL/6J小鼠的囊胚中，得到棕色嵌合体小鼠。选择高嵌合度小鼠与C57BL/6J小鼠杂交，获得了棕色子代小鼠。结论建立的2株129/ter小鼠ES细胞系具有种系嵌合能力，可用于利用基因打靶技术研制突变体小鼠的研究。, I2 m1 u( |* s4 @2 a
关键词胚胎干细胞建系显微注射9 j! Y  L7 {* |0 l$ _8 Z  V; Q
Establishment of a high germline competent
embryonic stem cell line GLDD-1from mouse129/ter strain8 Y9 H$ J% H3 f: s
Hou Ning，Cheng Xuan，Sun Yanxun，et al.3 h4 R2 ?2 c0 J' u1 H, N$ \. z2 @' @
Genetic Laboratory of Development and Disease，Institute of Biotechnology，Beijing 100071.
【Abstract】 Objective To establish the embryonic stem（ES）cell lines which could integrate into germline.Methods The E3.5blastocysts from mouse129/ter strain were collected and cultured on the fibroblast cell feeder layers.After4-6days of culture，the obviously proliferated inner cell mass（ICM）was isolated and disaggregated for subsequent culture.Embryonic stem cell（ES）lines which could be passaged stably were subjected to karyotyping.ES cell lines with XY karyotyper were introduced into blastocysts to evaluate their potential of germline transmission.Reˉsults 4embryonic stem cell（ES）lines which could be passaged stably named GLDD-1to GLDD-4were obˉtained.Over70%these ES cells have normal karyotyper.Two ES cell lines with XY karyotype.GLDD-1and GLDD-2were introduced into C57BL/6J blastocysts by microinjection.Germline transmission offspring were obtained by breeding the high degrees chimeras with C57BL/6J mice.Conclusion These results indicated that both GLDD-1and GLDD-2ES cell lines were able to integrate into germline efficiently and could be used for generating mutant mice using gene targeting.. k9 E7 h+ G, k/ E' @
Key words embryonic stem cell germline transmission microinjection
1981年Evans和Martin分别独立地从正常的小鼠囊胚中分离了小鼠胚胎干细胞［1，2］。小鼠ES细胞具有在体外无限增殖的能力，通过长期的体外培养和遗传修饰，经显微注射引入受体囊胚的细胞可以分化为成体的各种组织，并整合入生殖系［3］，小鼠ES细胞的分离和应用是ES细胞技术发展过程中的里程碑。它与同源重组技术的结合使得在生物整体水平上定向改变和修饰哺乳动物的遗传物质成为可能。作为基因打靶过程中的关键环节，具有正常核型，并保证在被引入受体囊胚时保持其高效的形成功能性生殖细胞能力的ES细胞系的建立和培养成为所有工作的基础。为了获得处于传代早期的ES细胞以进行基因打靶研究，我们建立了129/ter小鼠胚胎干细胞系，并对其核型和嵌合能力进行了检测，获得了具有正常二倍体XY核型并能进入种系的2株ES细胞系。* i5 j% r' d- r0 m9 x+ M/ H# B1 u
1 材料与方法. E; Z8 V2 [! l1 i* u
1.1 材料 129/ter小鼠由北京大学实验动物中心提供，昆明白鼠及C57B1/6J小鼠由军事医学科学院实验动物中心提供。特级胎牛血清、DMEM高糖培养基、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青-链霉素均购自Hyclone公司。β-巯基乙醇、丝裂霉素C购自Sigma公司。小鼠白血病抑制因子LIF购自Chemicon公司，35mm、100mm、150mm组织培养皿及四孔板购自Nunc公司。% p/ g3 F8 T& M, w/ _" P! i" _
1.2 滋养层细胞的培养和处理解冻小鼠原代成纤维细胞至2个100mm平皿中，于滋养层细胞培养液（DMEM，15鸖，0.1mMβ-巯基乙醇，0.1mmol/L青-链霉素，0.1mmol/L L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸）、37℃、5%CO 2 培养3天后，用胰蛋白酶消化处理并转移到6个150mm组织培养皿培养，3天后，再转移到40个150mm组织培养皿中培养3～4天，直到细胞铺满皿底。用终浓度为10μg/ml的丝裂霉素C处理成纤维细胞，37℃培养2～3h。将含丝裂霉素C处理过的，已失去有丝分裂活性的成纤维细胞冻存，制备为成滋养层细胞［4］。
1.3 ES细胞集落的分离及扩增从3.5天孕鼠子宫中收集囊胚及桑葚胚并培养于滋养层细胞上，培养基为滋养层培养基含LIF（1000U/ml），四孔板每孔培养1～2枚囊胚，培养4～6天后，将增殖明显的内细胞团（ICM）消化、离散、再接种至新的四孔板中，2次分离其中出现的ES细胞集落，传至35mm平皿中，记作0代［5］。+ X5 w; \& n: z! ~+ M1 ]: v, ~! y
1.4 核型检查将生长旺盛的ES细胞用秋水仙素（终浓度为0.02μg/ml）处理1h，常规空气干燥法制片，Giemsa染色15min ［5］。油镜下观察，分析50个细胞染色体，观察整倍体数目，计算出整倍体百分率，同时用图像分析仪进行染色体扫描，配对。
1.5 嵌合能力的鉴定用显微注射法将ES细胞引入C57BL/6J小鼠囊胚中，选用昆明白小鼠为假孕母鼠，所得嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配，根据后代毛色判断种系嵌合能力。由于供体ES细胞和受体囊胚来自不同毛色的纯色小鼠，只要得到的小鼠是毛色嵌合体，即说明该鼠是具有ES细胞整合的嵌合体小鼠。来自ES细胞的个体为棕褐色，而来自C57BL/6J的个体为黑色。
2 结果
2.1 129/ter小鼠胚胎干细胞系的建立收集小鼠E3.5的囊胚94枚，用小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层培养4～6天后，内细胞团增殖明显的囊胚数为39个（图1A）。ICM经胰酶离散后继续培养，其中10株形成ES细胞样集落。经2次亚克隆纯化后，最终获得了4株能够稳定传代的ES细胞系（图1B）。这4个细胞集落至今传代至18代，将之分别命名为GLDD-1，GLDD-2，GLDD-3，GLDD-4（表1）。& K: H) o; l, F, f' f3 X
图1 小鼠ES细胞系的建立略
表1 小鼠胚胎干细胞建系情况一览表略* C$ w* b0 r+ N% I4 n8 a
2.2 小鼠胚胎干细胞的核型鉴定 4个细胞系在第10代时进行了核型检查。GLDD-1、GLDD-2为XY型（图2），10代时具有正常二倍体核型的细胞比率约为75%，GLDD-3、GLDD-4为XX型，10代时具有正常二倍体核型的细胞比率约为70%。
图2 ES细胞的核型检查结果略/ B! ]4 P5 s( j9 W8 [% |+ R
2.3 小鼠胚胎干细胞的种系嵌合能力分析小鼠胚胎干细胞GLDD-1、GLDD-2通过显微注射引入受体小鼠C57BL/6J囊胚中。GLDD-1细胞移植2只假孕鼠，生育4只仔鼠，其中2只为棕色小鼠，雌、雄各一只，其余2只均为嵌合体小鼠。GLDD-2细胞移植2只假孕鼠，生育15只仔鼠。其中1只为棕色小鼠，为雄性（图3），其余10只嵌合度均在50%以上。将所获得的棕色小鼠与C57B1/6J小鼠进行杂交，观察种系嵌合情况，判断方法见“材料与方法”。来自GLDD-1的嵌合体中，棕色小鼠的种系嵌合率达75%，来自GLDD-2的嵌合体中，棕色小鼠的种系嵌合率达34%（表2）。
表2 GLDD-1、GLDD-2ES细胞种系嵌合体鉴定结果略
图3 GLDD-2嵌合体的获得略
3 讨论
小鼠胚胎干细胞（ES细胞）来自于受精后3.5天囊胚的内细胞团（ICM）［1，2］。在囊胚贴壁后，分离ICM的时机十分重要，以ICM柱状生长时离散最为恰当。早期分离则形成ES细胞的数目太少，而稍后分离可能会对ES细胞的全能性受到影响。我们选择5～7天时进行ICM离散。离散时尽量减少对ICM的损伤，我们采用200μl加样枪将ICM吸出，再进行消化重新接种，而在ES细胞亚克隆的分离时，我们采用口控管进行离散，这样对滋养层细胞以及周围的ES细胞克隆影响较小，最大程度地将所有的ES细胞离散，进行二次接种。
由于ES细胞是一种正常的胚胎干细胞，因此要求它具有正常的二倍体核型，核型不正常的细胞很难进入种系。研究中发现，XY型的细胞较XX型的ES细胞更容易形成种系嵌合体［5］。因此，早期的核型检查有助于尽早了解所得到的ES细胞系的使用价值。ES细胞在培养过程中，会出现少数细胞分化的现象，可采用提高滋养层密度或加大的LIF含量，可有效地得到控制。另外，ES细胞培养易受外界因素影响，对去垢剂十分敏感，故培养需使用一次性细胞培养耗材。
国内对ES细胞技术的研究从80年代后期开始，北京大学尚克刚等自1987年开始ES细胞的建系和研究工作，较成功地分离出不同小鼠品系的ES细胞系，并于1999年首次获得可进入种系的ES细胞系［6，7］。但国内未有用于基因打靶的ES细胞系的报道。本实验室于1999

作者: 张佳 时间: 2015-5-22 15:18

站个位在说

作者: nauticus 时间: 2015-6-20 15:11

宁愿选择放弃，不要放弃选择。

作者: yukun 时间: 2015-7-2 21:35

鉴定完毕.!

作者: 我心飞翔 时间: 2015-7-16 08:54

神经干细胞

作者: beautylive 时间: 2015-7-31 14:27

好人一个

作者: foxok 时间: 2015-8-4 14:01

病毒转染干细胞

作者: sky蓝 时间: 2015-8-5 16:42

我的啦嘿嘿

作者: xuguofeng 时间: 2015-8-17 14:54

进行溜达一下

作者: aakkaa 时间: 2015-8-28 14:27

你加油吧

作者: s06806 时间: 2015-9-1 08:35

谢谢分享了!

作者: 陈晴 时间: 2015-9-5 11:35

呵呵都没人想我~~

作者: tempo 时间: 2015-9-15 10:35

好啊，谢楼主

作者: dypnr 时间: 2015-9-28 08:27

造血干细胞

作者: 依旧随遇而安 时间: 2015-10-11 20:48

我帮你喝喝

作者: 榴榴莲 时间: 2015-10-12 10:02

站个位在说

作者: 我心飞翔 时间: 2015-11-4 07:34

不早了各位晚安~~~~

作者: MIYAGI 时间: 2015-11-8 17:43

病毒转染干细胞

作者: 依旧随遇而安 时间: 2015-11-28 12:43

真是天底下好事多多

作者: beautylive 时间: 2016-1-6 10:27

免疫细胞治疗

作者: 张佳 时间: 2016-2-6 13:25

呵呵大家好奇嘛来观看下~~~~

作者: 风云动 时间: 2016-2-26 18:33

羊水干细胞

作者: 命运的宠儿 时间: 2016-3-10 12:14

这个站不错！！

作者: 陈晴 时间: 2016-3-17 21:54

我又回复了

作者: 追风 时间: 2016-3-24 08:54

支持一下

作者: 小丑的哭泣 时间: 2016-3-24 13:17

(*^__^*) 嘻嘻……

作者: MIYAGI 时间: 2016-4-4 20:09

说的真有道理啊！

作者: biopxl 时间: 2016-4-11 12:43

顶下再看

作者: immail 时间: 2016-4-21 20:35

顶顶更健康，越顶吃的越香。

作者: 化药所 时间: 2016-4-26 17:15

一个有信念者所开发出的力量，大于99个只有兴趣者。

作者: doors 时间: 2016-5-4 22:06

生殖干细胞

作者: 蚂蚁 时间: 2016-5-13 10:18

给我一个女人，我可以创造一个民族；给我一瓶酒，我可以带领他们征服全世界。。。。。。。。。

作者: 水木清华 时间: 2016-5-17 16:18

有才的不在少数啊

作者: 小小C 时间: 2016-5-18 08:35

顶下再看

作者: 咖啡功夫猫 时间: 2016-6-4 13:18

支持~~顶顶~~~

作者: 黄山 时间: 2016-6-11 20:06

哈哈,这么多的人都回了,我敢不回吗?赶快回一个,很好的,我喜欢

作者: 蝶澈 时间: 2016-8-21 19:27

初来乍到，请多多关照。。。

作者: ikiss 时间: 2016-8-26 21:52

我帮你喝喝

作者: pspvp 时间: 2016-8-30 17:28

做对的事情比把事情做对重要。

作者: lab2010 时间: 2016-9-1 17:18

我也来顶一下..

作者: marysyq 时间: 2016-9-6 17:08

哈哈瞧你说的~~~

作者: 王者之道 时间: 2016-9-19 13:08

想都不想，就支持一下

作者: 某某人 时间: 2016-9-19 18:50

偶啥时才能熬出头啊.

作者: 修复者 时间: 2016-10-10 20:54

照你这么说真的有道理哦呵呵不进沙子馁~~~

作者: youngcell 时间: 2016-10-14 22:10

说的不错

作者: aakkaa 时间: 2016-10-15 06:43

我回不回呢考虑再三还是不回了吧 ^_^

作者: 剑啸寒 时间: 2016-10-16 03:57

希望可以用些时间了~````

作者: tempo 时间: 2016-10-19 21:11

有空一起交流一下

作者: 桦子 时间: 2016-11-7 10:54

帮你顶，人还是厚道点好

作者: 蝶澈 时间: 2016-11-23 22:54

我来看看！谢谢

作者: netlover 时间: 2016-12-13 20:07

神经干细胞

作者: 咖啡功夫猫 时间: 2016-12-20 15:52

留个脚印```````

作者: 温暖暖 时间: 2016-12-21 21:30

dc-cik nk

作者: laoli1999 时间: 2016-12-31 14:27

不错不错.,..我喜欢

作者: youngcell 时间: 2017-1-17 03:49

希望大家帮我把这个帖发给你身边的人，谢谢！

作者: Greatjob 时间: 2017-1-20 00:20

谢谢楼主啊！

作者: 某某人 时间: 2017-1-24 21:23

说的真有道理啊！

作者: 大小年 时间: 2017-2-7 09:27

支持一下

作者: 苹果天堂 时间: 2017-2-9 04:20

要不我崇拜你?行吗?

作者: myylove 时间: 2017-2-28 23:32

给我一个女人，我可以创造一个民族；给我一瓶酒，我可以带领他们征服全世界。。。。。。。。。

作者: 依旧随遇而安 时间: 2017-3-10 14:10

都是那么过来的

作者: heart10 时间: 2017-3-26 14:50

干细胞治疗糖尿病

作者: 心仪 时间: 2017-4-17 03:53

不错，支持下

作者: 三好学生 时间: 2017-4-23 04:47

不错，感谢楼主

作者: 小丑的哭泣 时间: 2017-4-28 08:28

留个脚印```````

作者: 咖啡功夫猫 时间: 2017-4-29 02:30

来上茶~~~~

作者: 安生 时间: 2017-5-10 11:54

我十目一行也还是看不懂啊

作者: 橙味绿茶 时间: 2017-6-1 20:01

(*^__^*) 嘻嘻……

作者: txxxtyq 时间: 2017-6-8 03:56

慢慢来，呵呵

作者: 糊涂小蜗牛 时间: 2017-6-16 09:35

免疫细胞疗法治疗肿瘤有效

作者: dypnr 时间: 2017-6-17 04:39

谢谢干细胞之家提供资料

作者: 咖啡功夫猫 时间: 2017-7-8 20:09

嘿嘿

作者: 海小鱼 时间: 2017-7-13 14:27

不错，看看。

作者: tuting 时间: 2017-7-14 15:35

真是有你的！

作者: biodj 时间: 2017-8-16 09:43

哈哈我支持你

作者: pengzy 时间: 2017-9-4 06:05

哈哈，看的人少，回一下

作者: 温暖暖 时间: 2017-9-13 21:42

你加油吧

作者: 命运的宠儿 时间: 2017-9-15 18:52

晕死也不多加点分

作者: highlight 时间: 2017-9-30 17:38

你加油吧

作者: 苹果天堂 时间: 2017-10-4 07:31

不错不错比我强多了

作者: frogsays 时间: 2017-10-7 10:26

好人一生平安

作者: 与你同行 时间: 2017-10-8 21:04

帮顶

作者: beautylive 时间: 2017-10-10 02:29

HOHO~~~~~~

作者: 草长莺飞 时间: 2017-10-16 22:27

想都不想，就支持一下

作者: dataeook 时间: 2017-10-31 14:25

支持~~

作者: aakkaa 时间: 2017-11-7 11:43

我十目一行也还是看不懂啊

作者: dr_ji 时间: 2017-11-18 11:18

我帮你喝喝

作者: 桦子 时间: 2017-11-21 11:35

不错啊! 一个字牛啊!

作者: beautylive 时间: 2017-11-23 18:42

留个脚印```````

作者: dogcat 时间: 2017-12-8 08:43

严重支持！

作者: 狂奔的蜗牛 时间: 2017-12-10 14:34

不对，就是碗是铁的，里边没饭你吃啥去？

作者: abc987 时间: 2017-12-19 10:27

顶一个先

作者: 科研人 时间: 2017-12-26 02:23

正好你开咯这样的帖

作者: lalala 时间: 2017-12-27 10:43

不错!

作者: 某某人 时间: 2017-12-27 11:54

很好！很强大！

作者: 科研人 时间: 2018-1-10 10:18

哈哈，看的人少，回一下

作者: 365wy 时间: 2018-2-2 21:56

我有家的感觉~~你知道吗

作者: xiaomage 时间: 2018-3-16 09:18

真是汗啊我的家财好少啊加油

作者: 某某人 时间: 2018-3-18 22:59

昨天没来看了～～

作者: ringsing 时间: 2018-3-29 19:10

写得好啊

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