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标题: 昆明种小鼠胚胎干细胞的培养及鉴定 [打印本页]

作者: 文献管理员    时间: 2009-3-3 12:25     标题: 昆明种小鼠胚胎干细胞的培养及鉴定

作者:高巍作者单位:辽宁医学院解剖学教研室,辽宁 锦州121001
* O0 c7 U% K! R8 `6 j6 v( i0 f                  
7 N  d; P' I! f7 s                  , B/ C2 I: a+ G" T* Q3 R
          " {& E+ e: Y/ s# l: ]* ]6 A% ^
                         , o6 v/ [: d* O7 [" J3 d! J0 ^! X
              z1 H6 d0 l. m5 M: ~' N4 U
                    
+ r# h  W( z: e, i* B" o" h            8 w( j  t% E4 g+ B3 d8 q: b: \
                     
2 @$ f* ^& J" d) Y0 N6 b6 [        2 w/ _( A2 r# a9 V5 ~( x$ D+ G( G
        
5 x$ o% _. a1 d+ [- \2 l        
% S! Y/ _  R2 f2 ?7 ?$ H          【摘要】  目的  从昆明种小鼠的早期胚胎中获取并培养胚胎干细胞。方法  收集小鼠3.5 d的囊胚培养,用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,形成的ES细胞样集落,72 h后分离隆起生长的内细胞团并继续培养,观察集落的生长状态,并通过碱性磷酸酶染色进行鉴定。结果  ES细胞有其典型的形态学特征:集落呈鸟巢状,边缘清楚,表面平滑,结构致密,隆起生长,细胞之间界限不清楚;单个细胞体积小、核大;对ES 细胞碱性磷酸酶进行检测,在AKP底物作用下,未分化的ES 细胞显微镜下为棕褐色,分化的不着色。结论  昆明种小鼠囊胚在小鼠胚胎饲养层细胞上可以发育为胚胎干细胞。 ( W, ]0 m7 N. f& I0 |/ _
          【关键词】小鼠 胚胎干细胞 ES细胞系( [5 g. J- \* K+ x
                  Isolation,Culture and Identification of Murine Embryonic
) D% e( F5 u5 V$ d  H3 }  S" D, T& E; N) p; ]0 K, a
Stem Cells of Kunming SpeciesGAO Wei1,LIU Fuqiang1,MEI Xifan1,LIU Chang2,REN Fu3
7 i) D- ~+ a  B: X- d% T4 j& k
& ~  p4 Z6 P0 p8 e! z) S(1.Liaoning Medical University;2.The First Affiliated Hospital ,Liaoning Medical University;
  z0 B; x: x9 S$ X/ B+ n4 ^- ~& J  ~. d
3.Department of Anatomy,Liaoning Medical University,Jinzhou 121001 China)Abstract:ObjectiveTo isolate and culture embryonic stem (ES) cells from Kunming species mouse. MethodsThe blastocysts of 3.5 d from Kunming species mouse were collected, cultured on the fibroblast cell feeder layers for 72 h. The cells from inner cell mass(ICM) were isolated and subsequently cultured in vitro.Then the stem cells were identified by AKP staininResultsThe ES cells had its typical morphological characteristics such as nest-like colonies, round or elliptic,with clear edge and smooth surface, strong refraction, significant swelling growth,compactness of cell aggregation, and obscure distinction between two edges of neighbour cells within a colony, relatively bigger nucleus compared with little cytoplasm. After the AKP staining, all of the ES cells showed strong AKP activity, and on the contrary, the embryonic fibroblast cells had no expression of AKP showing. ConclusionsThe embryonic stem cells can be isolated and cultured from Kunming species mouse.6 k8 A2 N4 Z: w4 {
" H  G) A9 q  g- V  V4 x+ |1 g+ l
Key words : Kunming species mouse ; embryonic stem cells! R  m# x2 J; I& q3 z+ n8 ?
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胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell, ES)是一种多能的未分化细胞,是从早期胚胎的内细胞团(inner cell mass,ICM)中分离出的多能干细胞。由于它可以参与胚胎发育,将所携带的基因导入受体,生成嵌合体,因此ES细胞已成为制作转基因动物的主要途径之一。也可以利用ES细胞模拟早期胚胎细胞的发育过程,分析参与早期发育中细胞分化与决定的因素,研究基因的调控,建立疾病的动物模型,利用ES细胞还可以为临床提供器官移植、修复器官或组织的原材料[1,2]。最近,基因打靶及基因捕获又成为应用胚胎干细胞进行研究的热点[3]。小鼠的ES细胞分离培养最早是在1981年由英国Evans和Kaufman[4]完成的,以后又有陆续建立了数百个小鼠ES细胞系[5-7]。但这些小鼠细胞系多来源于129,C57BL/6J等品系,而国内应用最广泛的昆明种小鼠ES的建系率很低。本实验尝试建立昆明种ES细胞系,为进一步的研究工作提供条件。
0 K% k0 {2 _# A4 q# O
. {, o" x0 M1 L1材料和方法* ~6 [, O. z0 O: S9 h8 j5 |) v

" j3 ]' C7 \& R" C6 j' G6 e8 H3 @1.1动物来源8 c; ~  _  o) u: J
7 \8 z0 w" A4 j# i+ C& E
来自辽宁医学院实验动物中心,昆明种小鼠,6~8周龄,体重25~35 g。) r' e- c: l' o5 d
- m9 ]- G  q! y- X, v, k
1.2试剂
7 G/ T& v+ |" n5 Z: `6 s! o% W: f/ p3 m0 V8 m  ~
丝裂霉素C(Mitomycin C,Sigma,M-4287),MEM培养基(GIBCO公司),胎牛血清(GIBCO公司),白血病抑制因子(LIF,CHEMICON公司),孕马血清绒毛膜促性腺激素(PMSG,杭州动物药品厂),人绒毛膜促性腺激素(HCG,杭州动物药品厂),碱性磷酸酶(AKP,南京建成生物制品研究所)% \) C. I  _" N1 Q! R) d' ~- S8 f' Y

3 |) {! }6 M( x/ `6 R5 _" s" w1.3细胞培养
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1.3.1饲养层细胞的制备无菌条件下取孕13~16 d的小鼠胚胎,去头,去尾,去胸腹腔脏器及四肢,用眼科剪剪成乳糜状,胰酶消化,机械吹打后种植于25 mL玻璃培养瓶中,加入含10%小牛血清(杭州四季青公司)、210-4 mol/L谷氨酰胺、10 μg/mLLIF、 50 U/mL青霉素的MEM培养基(Gibco公司)。于37 ℃,5%CO2培养箱中培养24 h,更换培养基后培养72~96 h至细胞融合,常规传代。将融合的鼠胚成纤维细胞加入含20 μg/mL丝裂霉素-C的上述培养基中培养2~3 h后,常规胰酶消化,单细胞悬液按密度1106/mL种植于6孔板中,细胞贴壁伸展后(约3 h),饲养层细胞制备完毕。$ `; L5 g% n; W& H6 f8 [
. y" Q9 ^! X, p
高巍,等:昆明种小鼠胚胎干细胞的培养及鉴定辽宁医学院学报2008年2月,29(1)1.3.2囊胚的获得用PMSG和hCG促进雌鼠超排卵,48 h后雌雄合笼, 阴栓检出日记为受孕0.5 d。孕3.5 d时无菌取出小鼠子宫,用含冲胚液(MEM+20鸖)的注射器冲洗宫腔,在解剖显微镜下收集囊胚移入已制备好的饲养层中。
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1.3.3囊胚的培养囊胚于饲养层细胞上进行培养,48~72 h后透明带自行脱落。将裸胚置于饲养层细胞上培养,使用ES细胞培养液。7 `2 Q6 K' {+ h% w, [) m" ~
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1.3.4ICM的分离72 h后去滋养层较彻底的裸胚已有ICM孵出并长大,3~5 d后ICM已长大2.5倍。在解剖显微镜下,用自制的口吸管连接140 μm的玻璃微针小心挑起ICM,使之与饲养层以及滋养层细胞分离,并吸至消化液小滴内(0.25%胰蛋白酶~0.04鞹A混合消化液),使ICM在消化液小滴内作用1~2 min,并用内径为70 μm的玻璃微针轻轻吹吸ICM,使之分散成若干个由细胞组成的小团块,这时可继续将ICM消化成单细胞,再分别移入新的饲养层细胞上继续培养。
, L1 }1 i+ k0 K+ s
+ N7 `& B1 N9 v; [) v1.3.5碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase ,AKP)染色鉴定小鼠胚胎干细胞。, A3 @0 v. Q; b# [6 o' c+ h; B

5 I, ]0 o2 n) v3 f8 R8 d5 ]; v2结果
+ ~9 O* @2 J9 k
9 a+ l! m/ X7 z( \5 M2.1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层
. }  I5 l3 b0 }3 H
( P/ d( a$ u' k0 ~由受孕13~16 d的昆明种小鼠分离、接种的鼠胚成纤维细胞(MEF,Mouse embrionic fibribric),开始为长梭型,长满培养皿底部时为卵石平铺状,具有典型的MEF细胞形态。第3~5代MEF细胞性状最为稳定,生长活力最佳,最适于处理为饲养层细胞。经处理的MEF细胞,在显微镜下观察,可发现其突起变短,细胞内出现均匀一致的黑色点状物,不再分裂增殖。
. v2 ^' m# a0 _- G; [* @
4 d: j7 `% P, J. a2.2ES细胞的分离培养
4 O  a) U, t( F
: K2 \6 {( W& o, b( s共收集57枚昆明种小鼠胚胎,其中囊胚39枚,桑椹胚18枚,其中共有31枚(54.6%)的ICM增殖到能够离散的程度(图1)。ICM离散后有4例出现了ES细胞样集落(12.9%),其余逐渐凋亡萎缩(图2)。将囊胚直接置于饲养层上培养,囊胚孵出透明带的时间约为48~72 h。
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% o/ U( a" `. ^% m! D1 W2.3ES的生长状态
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ES细胞有其典型的形态学特征:集落呈鸟巢状,将周围的MEF推开生长,边缘清楚,表面平滑,结构致密,隆起生长,细胞之间界限不清楚;单个细胞体积小、核大(图3、图4)。  d$ G. z3 {0 Q9 J& c0 _' c

: w# e" S/ k. P9 I2.4AKP组织化学染色
( m) O' n3 X* R
% a2 Q. E0 J' H+ ]9 t2 g& l未分化的ES细胞集落内存在高浓度的AKP,AKP染色可见ES细胞的核相对较大,胞浆染色成环状(图5);而分化后的ES细胞着色变浅甚至不着色(图6)。
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3讨论
* s; @  i5 a! l  u* c/ K
$ Z1 z0 u$ l2 p& \3 xES细胞极易受外界因素的影响,对生长条件要求非常苛刻。常规ES细胞培养液中含有高糖MEM、胎牛血清(ES cell Qualified)、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇和非必需氨基酸等,为了防止ES细胞发生分化,还要在培养液中加入白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),同时要有饲养层。胎牛血清的质量及浓度也是影响ES细胞生长状况的重要因素,为此本实验采用GIBCO公司生产ES cell Qualified 的胎牛血清,所加浓度为15%。分离培养ES细胞,最重要的前提条件是要最大限度地抑制细胞的分化。本实验采用小鼠胚胎成纤维细胞作饲养层并在培养液中添加LIF。一般认为饲养层细胞产生LIF,主要有分泌型和胞外基质相联的固定形式,可与ES细胞表面的LIF受体相结合,从而发挥抑制ES细胞分化的作用。在本实验中共用饲养层和LIF,其目的是为了能更好地防止ES细胞的分化。我们还发现传5代以内的鼠胚成纤维细胞具有同样让囊胚贴壁和ES集落生长的能力,在这样的实验条件下也能分离培养昆明小鼠的ES细胞。分离的ES细胞集落具有典型的ES细胞形态、AKP反应强阳性。/ A7 x0 f8 @9 ?
7 b- s  ^* K( \9 f4 v9 ~/ t, ]
ES细胞的培养是一项难度较大的工作,且现有的ES细胞系大多为国外品系小鼠所建立。昆明种小鼠是我国应用最多的实验小鼠,建立昆明小鼠的ES细胞系有利于其转基因动物的获得,能够为我国的科研工作更好地服务。本实验对昆明小鼠的ES细胞建系工作做了初步探索,为ES细胞多种属广泛建系的研究打下一定的基础。
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2 i" V2 o4 [9 Y0 G% e& v" @  q
/ i9 u; _, p' S5 J$ `8 B) S          【参考文献】
" q; i  g# G8 H- y[1]  Martin G R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryoscultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells[J] . Proc Natl Acad Sci USA ,1981 ,78 (12) :7 634 - 7 638.% R7 J& }; [! r. j9 f

/ G# [8 L0 ^1 Z' E% K; v: J% `! o, s. O9 f- P) ?  ]8 J

; v' L5 V. j9 W) d4 @5 _+ S$ S1 y7 p    [2]  Hooper M , Hardy K, Handyside A, et al. HPRT - deticient(Lesch - Nyhan) mouse embryos derived from germline colo2nization by cultured cells[J]. Nature ,1987 ,326 :2923., n0 _9 y# t2 Z6 [) f9 d

  S# |1 s8 N" x' y9 S' o3 E. o8 W5 E6 r$ @

% ^; T; H- u9 A, [) R3 F) j  W: Q    [3]  Evens MJ ,Kaufman MH. Establishment in culture of pluipot -entialcells from mouse embryos[J]. Nature ,1981 ,292 :154.
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' P$ Z5 q) q& g: W& y
- p( p1 o- j3 E0 i6 V1 H    [4]  Evans MJ,Kaufamn MH.Establishment in cultyre of pluipotential cells from mouse embryos[J].Nature,1981,292:154-156.4 A8 X0 ^& Z+ A1 `( |/ K. Z

3 y' L  r( {* A2 [* K( k1 z0 D1 N5 x" @' m
5 }. n# z" T$ q0 d+ I) I
    [5]  Eistetter HR. Pluripotent embryonal stem cell lines can be established from disaggregated mouse morulae[J]. Develop Grouth & Differ ,1989 ,31(3) :275.$ G5 p+ X' y5 A2 Q; j
& t! O  I& f  c% I& R! e/ s3 c
7 e! G  z6 t8 b  R: r- O; J

6 |# d5 w) V, ]- x9 U    [6]  Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci U. S. A. ,1981 ,78(12) :7634.
6 H# M$ Y% C# h! o) n! {+ `* Z8 _6 X+ D! L  ?1 s

; G# g% l! g3 l
* e$ T6 P- z& z5 B/ P0 z    [7]  丛笑倩,姚鑫.小鼠胚胎干细胞(ES-8501细胞)建系过程的核型及特性分析[J].实验生物学报,1987,20 (2):237.
作者: 红旗    时间: 2015-5-21 18:50

(*^__^*) 嘻嘻……  
作者: immail    时间: 2015-5-30 10:09

做对的事情比把事情做对重要。  
作者: biobio    时间: 2015-6-16 15:10

肌源性干细胞
作者: xuguofeng    时间: 2015-7-12 20:41

看或者不看,贴子就在这里,不急不忙  
作者: 红旗    时间: 2015-8-1 11:00

先顶后看  
作者: immail    时间: 2015-8-9 21:53

我想要`~  
作者: sky蓝    时间: 2015-8-10 15:17

嘿嘿  
作者: 罗马星空    时间: 2015-8-27 17:43

今天的干细胞研究资料更新很多呀
作者: MIYAGI    时间: 2015-9-9 13:27

好人一生平安  
作者: aakkaa    时间: 2015-10-7 15:52

干细胞研究还要面向临床
作者: 罗马星空    时间: 2015-10-28 12:18

来上茶~~~~  
作者: 罗马星空    时间: 2015-11-1 07:02

楼主good  
作者: 榴榴莲    时间: 2015-11-12 12:55

老大,我好崇拜你哟  
作者: 舒思    时间: 2015-12-15 17:27

干细胞之家是不错的网站
作者: 石头111    时间: 2016-1-4 19:51

端粒酶研究
作者: 123456zsz    时间: 2016-1-14 08:47

dc-cik nk  
作者: 剑啸寒    时间: 2016-1-18 20:09

水至清则无鱼,人至贱则无敌!  
作者: s06806    时间: 2016-1-21 21:27

这贴子你会收藏吗  
作者: 大小年    时间: 2016-1-29 12:11

淋巴细胞
作者: 罗马星空    时间: 2016-2-12 12:55

我好想升级  
作者: 陈晴    时间: 2016-3-2 15:10

免疫细胞疗法治疗肿瘤有效  
作者: doors    时间: 2016-3-25 22:16

看看..  
作者: xuguofeng    时间: 2016-4-5 16:34

拿分走人呵呵,楼下继续!
作者: 苹果天堂    时间: 2016-4-5 17:53

祝干细胞之家 越办越好~~~~~~~~~`  
作者: 与你同行    时间: 2016-4-15 12:54

不对,就是碗是铁的,里边没饭你吃啥去?  
作者: www1202000    时间: 2016-4-16 17:23

支持你加分  
作者: 再来一天    时间: 2016-4-24 15:43

严重支持!
作者: 修复者    时间: 2016-4-29 14:01

一定要回贴,因为我是文明人哦  
作者: HongHong    时间: 2016-4-30 19:00

站个位在说  
作者: 分子工程师    时间: 2016-5-7 12:35

顶下再看  
作者: mk990    时间: 2016-5-8 19:47

先看看怎么样!  
作者: 干细胞2014    时间: 2016-6-14 09:35

嘿...反了反了,,,,  
作者: 若天涯    时间: 2016-7-22 15:10

支持~~顶顶~~~  
作者: 甘泉    时间: 2016-7-27 13:01

风物长宜放眼量  
作者: 大小年    时间: 2016-7-31 09:46

干细胞研究还要面向临床
作者: dmof    时间: 2016-8-17 23:53

严重支持!
作者: hmhy    时间: 2016-9-20 09:42

我也来顶一下..  
作者: 草长莺飞    时间: 2016-9-29 17:09

偶啥时才能熬出头啊.  
作者: 小敏    时间: 2016-10-7 21:13

帮顶  
作者: 依旧随遇而安    时间: 2016-12-7 04:58

干细胞我这辈子就是看好你
作者: 咕咚123    时间: 2016-12-9 15:34

帮你项项吧  
作者: biopxl    时间: 2016-12-27 17:01

我帮你 喝喝  
作者: ladybird    时间: 2017-1-23 00:04

回贴赚学识,不错了  
作者: 风云动    时间: 2017-2-2 22:24

皮肤干细胞
作者: 123456zsz    时间: 2017-2-8 03:39

好啊,谢楼主
作者: 橙味绿茶    时间: 2017-2-12 10:41

这样的贴子,不顶说不过去啊  
作者: dmof    时间: 2017-2-20 12:08

表观遗传学
作者: 我学故我思    时间: 2017-3-2 09:55

不错啊! 一个字牛啊!  
作者: 初夏洒脱    时间: 2017-3-11 09:35

活着,以死的姿态……  
作者: hmhy    时间: 2017-3-22 14:01

好人一生平安  
作者: tuanzi    时间: 2017-3-26 06:28

这年头,分不好赚啊  
作者: 甘泉    时间: 2017-3-26 10:28

干细胞疾病模型
作者: foxok    时间: 2017-3-27 12:18

回复一下  
作者: 蚂蚁    时间: 2017-4-14 22:27

这贴?不回都不行啊  
作者: 依旧随遇而安    时间: 2017-4-16 23:52

做对的事情比把事情做对重要。  
作者: biobio    时间: 2017-4-21 16:02

回贴赚学识,不错了  
作者: beautylive    时间: 2017-4-26 22:05

原来是这样  
作者: 未必温暖    时间: 2017-5-13 07:02

21世纪,什么最重要——我!  
作者: tian2006    时间: 2017-5-16 05:35

…没我说话的余地…飘走  
作者: dmof    时间: 2017-5-23 13:54

又看了一次  
作者: dataeook    时间: 2017-5-24 02:38

不错啊! 一个字牛啊!  
作者: yukun    时间: 2017-7-7 16:54

正好你开咯这样的帖  
作者: 甘泉    时间: 2017-7-10 01:36

干细胞之家是国内最好的干细胞网站了
作者: wq90    时间: 2017-7-13 13:01

观看中  
作者: lalala    时间: 2017-7-16 13:15

这年头,分不好赚啊  
作者: 123456zsz    时间: 2017-9-2 23:57

干细胞行业门户 干细胞之家
作者: 我心飞翔    时间: 2017-9-12 01:59

皮肤干细胞
作者: 草长莺飞    时间: 2017-9-26 03:04

小心大家盯上你哦  
作者: 苹果天堂    时间: 2017-9-26 03:15

彪悍的人生不需要解释。  
作者: 干细胞2014    时间: 2017-10-5 19:32

厉害!强~~~~没的说了!  
作者: dongmei    时间: 2017-10-6 10:02

楼主good  
作者: mk990    时间: 2017-10-10 15:34

不对,就是碗是铁的,里边没饭你吃啥去?  
作者: 红旗    时间: 2017-10-11 14:44

我帮你 喝喝  
作者: leeking    时间: 2017-10-21 06:15

做一个,做好了,请看  
作者: biobio    时间: 2017-10-30 00:24

好困啊  
作者: xiao2014    时间: 2017-11-2 06:13

不错的东西  持续关注  
作者: 983abc    时间: 2017-11-11 10:01

发贴看看自己积分  
作者: 桦子    时间: 2017-11-21 14:32

谢谢干细胞之家提供资料
作者: 张佳    时间: 2017-11-29 16:27

其实回帖算是一种没德德,所以我快成圣人了  
作者: beautylive    时间: 2017-12-21 17:56

感謝樓主 干细胞之家真的不错  
作者: 再来一天    时间: 2017-12-24 02:47

转基因动物
作者: 剑啸寒    时间: 2017-12-29 17:23

昨晚多几分钟的准备,今天少几小时的麻烦。  
作者: kaikai    时间: 2018-1-7 03:10

我顶啊。接着顶  
作者: 龙水生    时间: 2018-1-13 01:52

神经干细胞
作者: 天蓝色    时间: 2018-2-26 10:55

应该加分  
作者: chongchong    时间: 2018-2-28 00:10

@,@..是什么意思呀?  
作者: cjms    时间: 2018-3-8 02:59

希望大家都有好运  
作者: doors    时间: 2018-3-15 18:09

初来乍到,请多多关照。。。  
作者: 坛中酒    时间: 2018-3-18 19:25

回个帖子支持一下!
作者: 刘先生    时间: 2018-3-19 20:02

好帖子,要顶!
作者: netlover    时间: 2018-3-29 22:05

羊水干细胞
作者: chinagalaxy    时间: 2018-4-3 03:16

支持你就顶你  
作者: 咖啡功夫猫    时间: 2018-4-3 21:10

站个位在说  
作者: aliyun    时间: 2018-4-16 07:33

太棒了!  
作者: 干细胞2014    时间: 2018-5-15 20:35

每天到干细胞之家看看成了必做的事情
作者: wq90    时间: 2018-5-16 09:18

胚胎干细胞
作者: xuguofeng    时间: 2018-5-22 10:43

看完了这么强的文章,我想说点什么,但是又不知道说什么好,想来想去只想  
作者: htc728    时间: 2018-6-6 11:35

每天早上起床都要看一遍“福布斯”富翁排行榜,如果上面没有我的名字,我就去上班……  
作者: 我学故我思    时间: 2018-6-7 16:18

这个站不错!!  




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