干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 羊骨髓间充质干细胞体外培养生长及诱导分化特性的观察 [打印本页]

作者: 文献管理员 时间: 2009-3-3 12:33 标题: 羊骨髓间充质干细胞体外培养生长及诱导分化特性的观察

作者：曹希武作者单位：河北省沧州市人民医院骨三科
   ( `% a& i( `! S' _/ F% A7 S# ~



         4 V# {9 E  C) x! V/ [* g  M# m  \

            H; _+ l4 P* u0 v
                  6 _$ z* C/ |/ U" k

      5 R/ \, q6 |% _" j# A- n

      【摘要】  目的：对羊骨髓间充质干细胞加以诱导分化，并分析其作为组织工程瓣膜种子细胞的可行性，探讨体外培养羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）和一般细胞生物学的特性。方法：采用成年山羊10只，麻醉后分别于股骨大转子穿刺抽取羊骨髓标本10ml，采用比重为1.07g/ml的淋巴分离液，接种于无菌的培养瓶中，利用多孔培养板，取第二、三代骨髓间充质干细胞，加入LG-DMEM条件培养基进行体外定向诱导分化。对诱导后培养的骨髓基质的间充质干细胞（MSCs）进行细胞生长测定及形态观察。结果：培养后的骨髓间充质干细胞和血管间质细胞形态相似，呈梭形或多角型，均24小时内贴壁，3～4天铺满瓶底。诱导分化后的骨髓间充质干细胞与血管间质细胞上清液羟脯氨酸含量基本相似，且生长曲线也相同。培养的MSCs粘附贴壁呈纺锤状，并有多个突起，潜伏期一般为24小时，接种后第8天MSCs生长逐渐缓慢，进入平台期。结论：诱导分化后所培养的间充质干细胞，具有独特的增殖和表型特征，是合适的组织工程瓣膜间质种子细胞。
      【关键词】诱导分化  组织工程  羊骨髓间充质干细胞  体外培养
   资料与方法: B: c" `, u9 W9 c

一般资料：本组实验采用成年山羊10只。主要试剂为水合氯醛、安定、粉剂DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、淋巴分离液、多聚甲醛（PFA）、免疫组化学试剂盒等。主要仪器包括细胞培瓶、24孔细胞培养板、1ml冻存管、超净工作台、离心机、CO2培养箱、倒置相差显微镜、振荡器等。0 ?/ G9 b/ r1 t- z
2 u4 w3 k( D4 ?) S
实验方法：①把成年山羊麻醉后，固定四肢，术区剃毛，常规消毒铺巾。分别于股骨大转子穿刺抽取肝素化骨髓10ml，稀释、离心、弃上清及脂肪层，其余细胞用LG-DMEM无血清培养基重悬，铺于等体积的Percoll淋巴细胞分离液上，离心收集单个核细胞，消化传代培养。取第二、三代骨髓间充质干细胞，加入LG-DMEM条件培养基进行体外定向诱导分化。对诱导后的细胞进行形态观察、免疫组化鉴定并绘制生长曲线。上述10只山羊抽取骨髓后，无菌条件下取大隐静脉，剥去静脉外膜，剪成1～3mm，贴壁法培养，消化传代。取第3代骨髓间充质干细胞与血管间质细胞，分别以5104L密度接种于24孔培养板，常规孵育96小时。每孔各吸取培养基0.5ml，测定两种细胞上清液中的羟脯氨酸含量。完毕后用胰蛋白酶消化对处于数生长期的细胞加入冻存液，调整细胞密度为7109/L置于液氮中，1周后复苏，计算两种细胞的存活率。反复种植3次，每两次间隔24小时，第4天各组均取出2份样本，扫描电镜观察。第7天向其余标本中加入四唑盐，采用酶联免疫检测仪490nm处骨髓间充质干细胞组、血管间质细胞组的吸光度值，比较两种细胞在去细胞主动脉瓣上的生长能力。②羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）的生长曲线测定：将细胞悬液接种于24孔培养板上，每孔1ml，每天取贴壁细胞的计数，连续8天计算均值，描绘细胞传代后生长曲线。③羊骨髓间充质干细胞的冻存：取生长期的羊BMSCs细胞（冻存前全量换液），用0.25%胰蛋白酶消化，离心收集，加入等量的冻存液，吹打均匀，以1ml/支移入无菌冻存管密封在-20℃，2小时后，移至零下80℃深低温冰箱中冻存8～10小时，然后移入-196℃的液氮中。④冻存羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）的复苏。取出冻存管后，迅速投入加有37℃温水的烧杯中移入超净操作台，然后将融化的细胞悬液移入离心管，加入完全培养液10～15ml，吹打均匀，加入完全培养基以1105个/ml接种于50ml培养瓶中，24小时后全量换液1次，以后常规培养。

统计学方法：统计学软件采用SPSS10.0，计数资料用X2检验。

结果* |7 j) T, s. q$ m8 A
9 F' g  r% s9 V" g7 x
培养的骨髓间充质干细胞黏附贴壁，均呈纺锤状，并有多个突起。一般细胞接种密度下的骨髓间充质干细胞，三代细胞生长周期基本一致，均为接种培养后第2～3天，但生长较缓慢，为生长迟滞期。3 天后细胞生长有快速增长过程，达到对数生长期，在7～8天时，细胞总数达到最高值，为生长平台期，其后生长速度逐渐减缓。免疫细胞化学染色后，显示所培养细胞的细胞膜抗原CD44均呈阳性。羊骨髓间充质干细胞的特征，是原代细胞在培养瓶底散在分布，呈圆形，胞体透亮，折光性好，很多的骨髓造血细胞混杂在内。在第9天换液后，悬浮细胞基本祛除，瓶底聚集生长的细胞形态多不规则，15天可见多处聚集生长的细胞群脱落，中心细胞为梭形，可见多个突起。根据生长情况每4～7天进行1次传代，传代细胞接种后 2～4 小时即迅速贴壁、伸展，6～10 小时左右活细胞基本完成贴壁。传代细胞的生长较原代较快，接种后7天即可铺满整个培养瓶底，冻存复苏的活细胞率大约为95.6%。羊骨髓间充质干细胞的生长曲线测定表明，其三代细胞生长周期基本一致，接种培养后，开始生长较缓慢，为生长迟滞期；3天后细胞生长加速，达到对数生长期；7～8天细胞数达最高值，为生长平台期，其后生长速度减缓。光镜下观察显示免疫细胞化学染色后的细胞膜抗原CD44有阳性表达。
% ~3 F+ N2 R4 e! ^9 ?4 {6 S
讨论1 X9 ^% |, }- z/ x7 y: f

本组实验结果显示，经过传代后即可得到纯度较高的羊骨髓间充质干细胞（BMSCs），所培养细胞的干细胞生长曲线也基本一致，这说明培养的细胞不是骨髓中的造血干细胞，来源应为同一干细胞，因为所培养细胞的细胞膜抗原CD44阳性。综上所述，本组实验结果证实了所培养的细胞是处于未分化阶段的骨髓间充质干细胞，具有较强的遗传稳定性和增值能力，可随冻随取，适于建立种子细胞库，是作为骨组织工程种子细胞的合适选择。
      【参考文献】; y' K. M* Z# K
1  顾春虎,王云雅,李亮,等.诱导分化羊骨髓间充质干细胞作为组织工程瓣膜间质种子细胞的可行性.中国组织工程研究与临床康复,2007,11(20).: A; b; I, _" T( H
# P' P' Z; u) U/ Y# K" W, ]5 g2 M
- R: b0 ]: i- |7 z5 _6 |
" K& k) S# t- o; v2 m- B5 K1 C
2  曹希武,苗军.羊骨髓间充质干细胞的体外培养及临床鉴定分析.中国社区医师,2008,10(9):11.

作者: 依旧随遇而安 时间: 2015-6-1 15:52

干细胞研究还要面向临床

作者: 陈晴 时间: 2015-6-9 18:35

来上茶~~~~

作者: marysyq 时间: 2015-6-11 21:54

我有家的感觉~~你知道吗

作者: laoli1999 时间: 2015-6-14 18:46

加油啊！！！！顶哦!!!!!

作者: tuanzi 时间: 2015-7-15 21:16

来上茶~~~~

作者: tuanzi 时间: 2015-7-17 21:11

楼上的话等于没说~~~

作者: nauticus 时间: 2015-8-15 18:35

偶啥时才能熬出头啊.

作者: s06806 时间: 2015-8-20 18:14

努力,努力,再努力!!!!!!!!!!!

作者: 张佳 时间: 2015-9-2 07:15

今天没事来逛逛

作者: immail 时间: 2015-9-13 10:00

问渠哪得清如许，为有源头活水来。

作者: 剑啸寒 时间: 2015-9-29 08:35

拿分走人呵呵，楼下继续！

作者: 张佳 时间: 2015-10-28 14:01

宁愿选择放弃，不要放弃选择。

作者: MIYAGI 时间: 2015-11-5 12:53

干细胞研究还要面向临床

作者: marysyq 时间: 2015-11-11 21:51

哈哈我支持你

作者: 舒思 时间: 2015-11-18 17:10

嘿嘿

作者: txxxtyq 时间: 2015-11-23 20:48

支持一下吧

作者: 命运的宠儿 时间: 2015-12-9 18:18

楼主福如东海，万寿无疆！

作者: sky蓝 时间: 2016-1-24 14:58

今天无聊来逛逛

作者: xuguofeng 时间: 2016-2-12 19:09

呵呵哪天得看看 `~~~~

作者: 狂奔的蜗牛 时间: 2016-2-24 14:10

帮顶

作者: 陈晴 时间: 2016-3-4 10:54

我是来收集资料滴...

作者: beautylive 时间: 2016-3-6 11:10

我该不会是最后一个顶的吧

作者: ines 时间: 2016-3-14 21:33

哦...............

作者: dypnr 时间: 2016-3-15 18:26

加油啊！！！！顶哦!!!!!支持楼主，支持你~

作者: nauticus 时间: 2016-4-8 17:01

今天再看下

作者: IPS干细胞 时间: 2016-4-19 22:55

爷爷都是从孙子走过来的。

作者: nauticus 时间: 2016-4-25 07:26

HOHO~~~~~~

作者: 快乐小郎 时间: 2016-6-12 14:53

既然来了，就留个脚印

作者: qibaobao 时间: 2016-7-25 13:35

干细胞从业人员

作者: qibaobao 时间: 2016-8-21 13:54

谢谢分享了!

作者: mk990 时间: 2016-8-26 14:36

任何的限制，都是从自己的内心开始的。

作者: 剑啸寒 时间: 2016-9-25 14:10

看贴回复是好习惯

作者: xiao2014 时间: 2016-10-27 13:34

加油啊！！！！顶哦!!!!!支持楼主，支持你~

作者: 墨玉 时间: 2016-11-17 12:27

怎么就没人拜我为偶像那?? ~

作者: kaikai 时间: 2016-11-17 22:07

我好想升级

作者: hmhy 时间: 2016-12-3 18:10

不错不错.,..我喜欢

作者: 草长莺飞 时间: 2016-12-6 18:06

青春就像卫生纸。看着挺多的，用着用着就不够了。

作者: MIYAGI 时间: 2016-12-27 17:53

支持你加分

作者: nosoho 时间: 2017-1-24 06:06

我来看看！谢谢

作者: alwaysniu 时间: 2017-2-26 11:52

昨晚多几分钟的准备，今天少几小时的麻烦。

作者: 蝶澈 时间: 2017-2-27 02:33

我毫不犹豫地把楼主的这个帖子收藏了

作者: 兔兔 时间: 2017-3-8 12:19

有才的不在少数啊

作者: IPS干细胞 时间: 2017-3-16 00:16

我毫不犹豫地把楼主的这个帖子收藏了

作者: SCISCI 时间: 2017-3-20 20:09

祝干细胞之家越办越好~~~~~~~~~`

作者: feixue66 时间: 2017-3-20 23:30

呵呵，找个机会...

作者: 365wy 时间: 2017-3-21 17:11

好困啊

作者: doors 时间: 2017-4-3 04:04

哎怎么说那~~

作者: 张佳 时间: 2017-4-21 13:35

不错啊! 一个字牛啊!

作者: 初夏洒脱 时间: 2017-5-3 15:01

不早了各位晚安~~~~

作者: 苹果天堂 时间: 2017-5-18 14:18

不管你信不信，反正我信

作者: SCISCI 时间: 2017-5-20 11:45

也许似乎大概是，然而未必不见得。

作者: bioprotein 时间: 2017-5-22 22:27

必须顶

作者: 老农爱科学 时间: 2017-6-3 09:42

楼主，支持！

作者: 红旗 时间: 2017-6-4 06:40

嘿嘿

作者: 小敏 时间: 2017-6-9 14:00

晕死也不多加点分

作者: biopxl 时间: 2017-6-12 14:27

说嘛1~~~想说什么就说什么嘛~~

作者: 小敏 时间: 2017-6-15 01:56

真是汗啊我的家财好少啊加油

作者: 丸子 时间: 2017-6-19 07:10

神经干细胞

作者: 碧湖冷月 时间: 2017-7-10 10:01

dddddddddddddd

作者: ringsing 时间: 2017-7-12 18:01

干细胞库

作者: 风云动 时间: 2017-8-3 10:18

说的真有道理啊！

作者: ringsing 时间: 2017-8-13 11:42

我该不会是最后一个顶的吧

作者: biobio 时间: 2017-8-18 22:59

好人一个

作者: awen 时间: 2017-8-21 10:27

胚胎干细胞

作者: 狂奔的蜗牛 时间: 2017-9-3 20:07

我在努力中

作者: dogcat 时间: 2017-9-6 04:55

琴棋书画不会，洗衣做饭嫌累。

作者: biodj 时间: 2017-9-17 21:24

有空一起交流一下

作者: 杏花 时间: 2017-10-1 12:00

嘿嘿......哈哈......呵呵.....哟~呼

作者: 海小鱼 时间: 2017-10-4 02:54

顶．支持，路过．．．．．

作者: www1202000 时间: 2017-10-18 11:10

干细胞行业门户干细胞之家

作者: dd赤焰 时间: 2017-10-23 18:52

加油啊！！！！顶哦!!!!!

作者: 蚂蚁 时间: 2017-11-30 11:43

水至清则无鱼,人至贱则无敌!

作者: ringsing 时间: 2017-12-14 05:54

不错不错.,..我喜欢

作者: 初夏洒脱 时间: 2017-12-14 09:54

ding 支持

作者: 黄山 时间: 2018-1-5 16:10

干细胞研究还要面向临床

作者: 生科院 时间: 2018-3-12 18:08

免疫细胞治疗

作者: popobird 时间: 2018-3-17 04:18

一楼的位置好啊..

作者: 与你同行 时间: 2018-3-19 11:54

哈哈,有意思~顶顶，继续顶顶。继续顶哦

作者: aakkaa 时间: 2018-3-19 12:25

长时间没来看了～～

作者: 草长莺飞 时间: 2018-5-19 04:15

我有家的感觉~~你知道吗

作者: mk990 时间: 2018-5-22 14:51

几头雾水…

作者: bluesuns 时间: 2018-6-27 13:00

好帖，有才

作者: 温暖暖 时间: 2018-6-30 12:54

免疫细胞疗法治疗肿瘤有效

作者: 一个平凡人 时间: 2018-7-8 19:24

貌似我真的很笨????哎

作者: na602 时间: 2018-7-20 01:59

发贴看看自己积分

作者: 干细胞2014 时间: 2018-7-20 22:43

好啊，，不错、、、、

作者: cjms 时间: 2018-7-24 10:27

小心大家盯上你哦

作者: 3344555 时间: 2018-8-16 15:17

嘿嘿

作者: qibaobao 时间: 2018-8-19 19:53

好好帖很好帖确实好帖少见的好帖

作者: abc987 时间: 2018-8-21 01:01

不错啊! 一个字牛啊!

作者: 加菲猫 时间: 2018-8-21 02:10

干细胞研究人员的天堂

作者: sshang 时间: 2018-9-17 17:34

表观遗传学

作者: 科研人 时间: 2018-9-23 07:07

爷爷都是从孙子走过来的。

作者: 陈晴 时间: 2018-9-24 20:28

你加油吧

作者: 快乐小郎 时间: 2018-10-6 00:48

一个人最大的破产是绝望，最大的资产是希望。

作者: 初夏洒脱 时间: 2018-11-12 03:09

这个贴好像之前没见过

作者: 蝶澈 时间: 2018-11-18 05:56

支持~~顶顶~~~

作者: 丸子 时间: 2018-12-10 22:32

干细胞与动物克隆

作者: marysyq 时间: 2019-1-4 18:30

不错，支持下

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)