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标题: 骨髓干细胞就鉴定有图 [打印本页]

作者: 骨道边 时间: 2011-6-1 18:42 标题: 骨髓干细胞就鉴定有图

[attach]27893[/attach][attach]27892[/attach]软骨出来了，可是骨髓基质干细胞长的还不行，现在我都不知道是不是干细胞了。让我一个做成骨细胞的师姐看了一下她说是成骨，让做软骨的师兄看他说是软骨。搞得我都很晕了。希望大侠们指点。现在简单把我的整个过程跟大家说一遍，有什么不足的请指正。
  1.取160-180g的SD大鼠一只，用3%戊巴比妥钠1.5ml（致死量）麻醉，拨皮，手术器械取下整个下肢，需要软骨的话注意不要把股骨头关节面破坏了。75%酒精泡15分钟移入超净台。7 b9 c) c  L1 }8 Z- {+ D3 L
  2。用pbs漂洗两遍以上，在一次性培养皿中剃掉多余的软组织，剃的越干净越好。
  3，移入另一个培养皿，倒上点pbs，用手术刀削下股骨头上的软骨，注意不要削到软骨下骨，还有把半月板也取下来，剪碎。收集到离心管中胰蛋白酶37度摇床中消化10分钟后弃上清，加入二型胶原酶在培养箱中消化，分别于24h和48h分两批收集软骨细胞。（如果补需要软骨的战友们可不用这一步）
  4，用止血钳固定已经分离好的股骨和胫骨，用咬骨钳要掉两端。此时需要一个新的培养皿加入新鲜的α-MEM10ml左右，用10ml的注射器吸取培养液来冲洗骨髓到培养皿中，反复冲洗3次以上，剩下的骨头都这样处理，冲下来后在用吸管来充分吹打匀悬浮细胞。
  5，将混悬液移入培养瓶中放到培养箱中培养
  6，前三天不去看它，也不要过多的打开培养箱0 t+ U$ d% u7 X( I4 H% i0 Q; N
  7，第四天给予办换量换液
  8，第五天全换量换液，并用pbs冲洗两遍，如果瓶底发现杂质较多可用吸管在瓶内吹打瓶底的杂质, Q' L3 t  ?5 P' c( Y
  9，接下来就是换液，看细胞的生长状态% B( ~" u) l  }0 G, k$ }+ N5 I' D

以上就是我的整个实验步骤，结果是我的细胞是长出来点了，可是瓶底的杂质较多，所以我每次换液的时候都要把pbs灌满培养瓶用吸管吹打瓶底，只要是贴住的细胞不会被吹下来的这可以放心，如果挂到就不敢保证了。可是那些杂质和细胞碎片很难被吹下来。所以我的细胞没有长成一大片而是散在的小团伙。: _* n% w" S* T7 P3 E
  我是5月20号做的，到今天拍的片子，请大家看看给我鉴定一下是不是干细胞，下一步该怎么办，是传代还是直接传到六孔板中爬片鉴定啊。

作者: 骨道边 时间: 2011-6-1 18:48

[attach]27897[/attach][attach]27896[/attach][attach]27895[/attach][attach]27894[/attach]

作者: 骨道边 时间: 2011-6-1 18:49

大图为40倍镜下，小的为20倍镜下

作者: 骨道边 时间: 2011-6-1 18:55

[attach]27899[/attach][attach]27898[/attach], U" x# Q/ [0 S6 ]4 c! w

补充内容 (2011-6-1 18:57):
请大家不要责怪，第一次用上图请原谅。拍图也是第一次拍，这两张也是20倍镜下图片。

作者: 皮搋子 时间: 2011-6-1 19:06

8，第五天全换量换液，并用pbs冲洗两遍，如果瓶底发现杂质较多可用吸管在瓶内吹打瓶底的杂质&
( [; h2 y7 \, X) h- t
这步貌似有问题吧，你说的杂质是什么？

作者: tangyvhuang 时间: 2011-6-1 19:18

有点像间充质干细胞，这密度还是养几天看看吧。步骤没什么问题，我觉得直接爬片鉴定吧，有时候形态不说明问题，也许你看着不像的细胞他就是呢。诱导一下呗

作者: 文武庙 时间: 2011-6-1 19:30

个人也觉得仅凭形态难说明哪种细胞，如果能测表型神马的，还是上个流式啥滴比较好！

作者: wenfeng8212 时间: 2011-6-1 19:54

我觉得应该先纯化一下间充质干细胞吧。用4倍看一下细胞密度，细胞密度到80%左右，就传代。

作者: 骨道边 时间: 2011-6-1 21:46

回复皮搋子的帖子- C& M. @, g: n' L9 d/ [
( s7 e8 x; L' L* w8 V& A
因为全换液量的时候好多细胞，本人觉的是血细胞吧，它也不长，冲也冲不掉，就是圆圆的。冲掉的那些细胞就留下了小点点。那些就是杂质吧* c F9 d6 p0 l

作者: 骨道边 时间: 2011-6-1 21:49

回复 tangyvhuang 的帖子- @# k4 Z2 x8 c5 g- W. ^! {

我做的是先把干细胞养出来再诱导成软骨，所以如果它不是干细胞的话就诱导不出来了。那先养一养吧。等它长多了传一传代，留点本钱，第一次养出来。呵呵。。。谢了，以后向你请教哦# }! M: U2 V; b8 _

作者: 骨道边 时间: 2011-6-1 21:52

回复 wenfeng8212 的帖子5 j' z* W2 p% b9 J! g/ Q1 |- U

好的，也是这么考虑的，就怕它长不到那么多，有些细胞师姐说状态不怎么好了，伸展的不是那么大，开始有点回缩了。回缩了是说明这细胞的活力差了吧，只能再养养看了。谢谢了，请多指教

作者: 骨道边 时间: 2011-6-1 21:55

回复文武庙的帖子

可是我这一瓶就够做这么一次，传代会不会让细胞纯化一点啊。今天怎么听到我师姐说越传细胞越不纯，真有此现象吗

作者: taxuewuge 时间: 2011-6-1 22:55

上图是原代的图吗？我做的原代数量比你的多，基本上贴满培养瓶的80%才传代的，我做原代用的是全骨髓离心法，得到的细胞相对纯，而且我是把鼠的肱骨和股骨的骨髓全用D-Hank's液冲出来的，所以离心后得到的细胞数量较多。如果上图是原代的话，我觉得细胞量太少了，传代可能会导致密度太小，细胞长不起来，建议在培养一段时间。注意细胞都有一定的生长周期，时间长了，细胞就会衰老，所以一定要注意观察细胞的形态。如果培养后不行的话，就重做吧。

作者: 骨道边 时间: 2011-6-2 12:52

回复 taxuewuge 的帖子! Q' R' C0 K1 j, K) R

好的，我做的就是原代的，步骤就是我说的那样，没有离心。再看看，不行那就重做了。我这次的问题是不是第一次换液的时间间隔有点长也有关系啊？两天就第一换液的话是不是就可以吧那些不贴壁的细胞冲的干净点，瓶底也干净点细胞好长？谢谢指导

作者: taxuewuge 时间: 2011-6-2 18:04

我取原代是用离心法，得到的细胞相对较纯。所以分离后第三天就进行半换液。如果细胞5天还不贴壁的话基本上以后也贴不了。第二天就把不贴壁的细胞冲干净，就会让一些贴壁较慢的细胞无法贴壁，那样瓶子里贴壁的细胞太少，达不到一定的密度，细胞就会长不起来，而且传代以后细胞的量就更少，根本无法长满瓶底。我养细胞才一个月，以上只是我的拙见，仅供参考，有不对的地方请多多指教。

作者: 临床干细胞 时间: 2011-6-2 19:15

我觉得挺像，应该是干细胞没问题

作者: ytumuyangren 时间: 2011-6-2 23:40

看着形态和我刚开始养的软骨有些像，刚开始我同学以为是纤维细胞呢，但是老板说软骨细胞没长起来之前也会是长梭形的，因为他们都是来自中胚层的分化。所以不能单纯的就形态说明是什么细胞，养养看吧，祝你好运。呵呵！

作者: 骨道边 时间: 2011-6-3 15:34

好的，希望它能长起来了，今天以看1号传代的软骨细胞长的真是疯狂啊，都长满了，我赶紧给冻存了，可是今天师姐感冒了不来科里，老板这两天都不在，不知道又上哪里旅游去了，只能自己来了。你冻存过么？有什么注意的地方跟小弟我说一下啊。谢了

作者: liuerfu 时间: 2011-6-3 23:06

我做的是先把干细胞养出来再诱导成软骨1 ^4 f& V; t6 {. q% M4 X) e
你可以用鉴定软骨的方法鉴定一下，看是不是软骨细胞

作者: liuerfu 时间: 2011-6-3 23:09

我看别人提的干细胞也只是形态上大致管擦一下，只是在细胞确实长得像msc时才用流式细胞仪检测。

作者: 骨道边 时间: 2011-6-4 20:18

那你那里有干细胞的形态的图片吗，我也不知道什么时候才长得确实像干细胞啊，呵呵

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