# e1 c: C, C: _2 N+ {8 f/ Y4 V在这个背景下,近两年出现了一些试图整合现有证据,提供具有指导意义的机制框架的努力。从发表在主要杂志上的重编程综述来看,无论是2 w# q5 ^' J! P0 C7 Z: W" G5 s+ I
文章数量还是关于机制探讨的篇幅,都有比较大的增加。各家的文章自然是试图利用现有实验证据来对可能的机制模式画图,这可以说是一种 0 V/ ^' f& j) o! v7 a3 s“内视”的角度。这里则试图从这些文献的特点及其演变过程出发,看人们探索重编程机制的所经历的思路过程。可以看作是更接近于文献学' p1 P. ~' k3 Q: u) E
习性的seminar,而不是试图综合现有的文献内容勾勒出一个mata-analysis。也可说是一种相对的“外观”。# x+ r4 F! \5 j: W; l0 ?9 i. N
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关于重编程的代表性综述文献选择,从iPSC发端之前关于核移植的认识开始,直到2011年上半年多篇最新文章,大约选了15篇左右,一些文章: {6 r$ H8 U A" ?( k" E/ y" e/ @! E
具有内在的延续性。综述文章中,关于机制的探讨篇幅和深度各有不同,早期的自然浅一些少一些,越到近期越深一些。首先对各文章中关于 ; D8 K. g+ Z. i( [/ w7 c, `' s' q( M5 O重编程理论机制的探讨做一个大致的描述性摘要,在这个基础上试图总结出一些规律性的东西:现有公认的重编程机制的主要内容,以及关于, f# Z0 B8 q! R8 z$ t1 v
重编程机制思考过程的一些特点及其历史演变过程。这两者往往是结合在一起的。9 q$ I3 e# `/ {/ \5 x
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所选择的涉及重编程机制的理论性文章,在侧重点,文章结构以及表达方式上多种多样,关于机制的描述层次也各有深浅,这种多样性也恰反 / T& z. n9 r2 ]6 e, r* U, K映了目前对所谓重编程机制认识的高层不确定性,也就是说尚不存在一个公认的重编程机制的理论模式。换句话说,对机制的认识还停留在寻 6 Y7 @/ M' G4 k- [找合适的高层次理论框架上。7 }0 [6 b }2 i
" u+ S% q' B' O: @+ p * [ ?6 V" p3 [, K' d" Z9 {7 N) t3 {9 iI。Nuclear reprogramming and pluripotency 6 e# q- w7 E. i2 @% a' G+ w! X+ K 5 z2 b4 A) Q. s8 vHochedlinger & Jaenisch 29 June 2006 Nature Insight Review0 q N* {8 i N8 d
7 l. Q- [" D* T: b9 Q( ]# c$ P+ N这是发表在2006年鼠iPSC出现前夕的一篇关于当时的四种重编程方法:核移植、细胞融合、细胞提取物、培养条件诱导重编程的经典综述,某( `8 l5 L% t$ Y3 C
种意义上说提示了因子诱导重编程的出现。而且,比较明确地把细胞重编程与干细胞多能性结合在一起考虑。 4 H" H9 t3 o: l/ p, `7 W+ i9 |, f7 t) o* _0 Q$ J/ c
该文梳理了上述四种经典“细胞核重编程”的现状后,认为重编程的演技仍然停留在“功能水平”,“现象水平”上,急需在细胞水平、分子 + }0 ~3 A/ I- {3 Z$ D; q- I水平和生物化学水平解构重编程的机制和过程。强调需要确认表观遗传在重编程中的作用机制,提出了细胞融合重编程中是否染色体被重编程8 q* K9 v6 i! X) }' F }
为多潜能的问题,细胞提取物重编程中Oct4的作用,培养条件重编程研究中PGCs-Oct4;imprinting erase的问题。 # C. g8 N, ~% U) O3 T/ E6 L, E" G7 o* y+ n* N8 U1 j8 N
在“Molecular mediators of reprogramming and pluripotency”标题下,对重编程的可能机制作了一些推断。讨论了ESC多能基因和条件在重编6 e; d$ {# ]8 r& E0 O5 E0 B
程中的可能作用:signal transducer、transcriptional factors在重编程中的可能作用。通过Oct4,Nanog和Sox2在体细胞核移植囊胚中有不完全 * W+ z( K9 F: F3 A) c激活而在胚胎干、EG或EC来源克隆囊胚中有正常表达的现象,提示这些多能因子在重编程中可能具有重要的作用。8 Z& W6 y/ _1 w5 g: A% v
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关于下一步的研究方向,该文提出:关键多能因子网络的很多下游基因同时也是PcG的靶子,这一点提示染色质conformation与上述因子相关。 , ~& n( |# w4 g' E' ^4 A m与因子相关的conformation具有“双极域”特性——inhibitory histone H3 lysine 27 methylation marks and activating histone H3lysine 4 : f3 j) ]- T" m6 f* {# Umechylation marks。这些双极域在分化细胞中丢失,提示其在维持ESC发育可塑性的作用。在分化细胞中,OCT4,SOX2和NANOG有可能与PcG ( }8 B% g. n% O" ^$ Y* j! K5 A蛋白合作,一方面沉默多潜能状态的发育调控因素,同时,recruit表观遗传正面调控因子,激活分化相关转录过程。一旦搞清楚ESC的多能性 i* ^! n" [8 w9 F* \# I
和自我更新转录调控网络的分子机制,就有可能通过影响这个转录网络的关键步骤来重编程一种细胞类型为另一种细胞类型。 * N' |0 _: b3 F6 m/ F 7 {+ m' G, Y! n- ^Looking ahead:有无可能不通过暴露细胞核到卵环境来重编程体细胞?能否找出重编程的基因和通路?因子诱导的体细胞de-differentiation的 8 I& Q- @' s( z; U4 u2 D4 N7 H例子,如外源性激活OCT4导致成年鼠前提细胞扩增并形成肿瘤,而turn off OCT4肿瘤消退。提示成年前体细胞是理想的重编程来源细胞。因此," J: [9 F* o: j9 ?( f3 e
有可能采用功能增减策略,来鉴定有利于成体细胞重编程为胚胎干样细胞的因素。利用胚胎干抵制DNA甲基化丧失的能力来挑选重编程的细胞 4 ^3 F4 N8 l9 D(其他任何细胞都不具备这个抵抗能力)。 6 v- g* _ S! H$ n; F ) Q' I- E* F2 g1 V9 [. w% U非卵环境、重编程基因、外源性激活OCT4去分化,这已经是后来Yamanaka iPSC思路的雏形。关于重编程中涉及的基本概念都有了,不过还是8 k5 y9 O# g+ r0 V5 M6 m
不连贯的,不完整的。 ! T# N) j4 k# o; q! q0 r' t- [. D+ r8 J3 [" U: V' h
有趣的是,Yamanaka鼠iPSC结果发表于此文两个月后:online August 10,2006 Cell。 % q* P6 l' K- G2 |5 x6 G, Y1 Z 3 T G4 s& q% e* ?( h1 N- M, A. q3 i1 x2 h
II。Strategies and New developments in the generation of patient-specific pluripotent stem cells3 A$ f0 D1 ]1 {, U3 o' D
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Yamanaka, Cell Stem Cell July 2007 Review D# d& V; \! @) u" E' Q, x 5 W) t9 i- W2 O2 X, p6 o$ B/ h2007年Cell Stem Cell发刊号上登载了Yamanaka关于iPSC的一篇Review,概述了鼠iPSC一年间的进展,在谈及可能的“机制”时采用了比较 - A; _! i! f: |/ r“朴素”的问法: 7 w# _1 G' |' v) m3 u( P - ^4 W; f. F, L7 b' q- p; sHow do the four factors induce pluripotent stem cells?! a0 x, `! n3 b) Y- r3 }
* z: f, p8 L$ U1 r. E! E3 U他强调胚胎干以及其他多能干与肿瘤细胞在很多方面类似,例如其永生性和快速增值特点。推测这可能是需要肿瘤相关基因c-Myc和KLF4来诱0 Q: l2 u: m; Y9 y( j
导iPSC的原因。这两个因素本可以诱导细胞为肿瘤细胞,而加上Oct4和Sox2可能转移了变化方向,成了iPSC。推测关于iPSC低效率的原因之一,1 E `0 G8 I0 h7 f! A
是来源细胞中少数progenitor被重编程为iPSC。另一个可能是还需要其他因素的参与,包括多能因子和染色质重塑因子如ISWI和Brg1。此外, / t! O9 _. n+ ?, h各种因子之间的比例和表达模式的平衡很可能起关键作用,例如Oct3/4过度表达破坏多能性(看到了多能因子在多潜能性上的双重作用)。" t. _4 }- e; O' |! V, r) I
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此文4个月后,Yamanaka & Thompson实验室关于人iPSC文章同时发表(online November 20 2007)。, |; n& v& c0 H- K+ z
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III。The First Direct Reprogramming of Adult Human Fibroblasts * Z% A6 g! @. \ 5 v ^' Z+ i" C [Ian Wilmut Cell Stem Cell 1, December 2007 Previews* ^' [$ F2 n, J4 K1 L! P L) }7 D. G
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人iPSC发表一个月后,克隆羊之父Ian Wilmut在Cell Stem Cell上发表了一篇简短评述,指出iPSC是体细胞克隆的后续进展。并认为至少就直接 ) o& |5 f! H3 E$ E% w重编程细胞而言,iPSC技术将很快使体细胞克隆技术失去价值。有趣的是,治疗性克隆(therapeutic cloning)也是在2007年首次得到证明。, _0 s3 m1 k9 H$ P
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关于iPSC的可能分子机制,Wilmut指出Oct3/4 and Sox2 可以上调多能性核心基因的表达,推测c-Myc 和 Dlf4 修饰染色质结构以使得Oct3/4 % D1 Z! [8 `+ E" R) Q和Sox2可以与这些关键基因结合。这一点与前述Yamanaka等人的推测一致,当然后来证明c-Myc等oncogenes不是必需的。 3 {& W; r( H1 V5 e9 O4 P% A8 w2 D% \3 J( { t3 u
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IV。Stem Cells, the Molecular Circuitry of Pluripotency and Nuclear Reprogramming3 ~- H7 t4 d; a& A$ j/ k& W# i
. m" k/ H, u6 m2 AYaenisch and Young, Cell, February 22, 2008, Leading Edge Review , y' ?6 b: c. U; s+ w4 n ! j: z! t0 _" K# Z' H3 x2006年iPSC出现后的不到两年时间内,因子诱导多潜能干细胞研究多在不停发现这个模式的一些新现象,比如四个因子的必要性,诱导过程的 3 F8 o; ]; |3 L, |/ j/ |( z中间状态等。如前所示,iPSC发表之前,Yaenisch关于核移植重编程的综述预示了iPSC技术的出现。一年多后,Yaenisch延续了前述综述的思路,! |7 [+ p/ M' ~* Y+ Q, D1 P
结合iPSC的新现象,对多潜能和“核重编程”的分子通路进行了描述。重点围绕iPSC提出的新情况,列出了一些必须考虑的问题。' v5 Z, G- R" r, Y