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标题: 有关脐带消化问题 [打印本页]

作者: tkpss18 时间: 2011-9-15 11:44 标题: 有关脐带消化问题

请问有没有人是用透明质酸酶和胶原酶来做脐带消化的？$ H: E$ r6 a3 h% ~
我们实验室的实验做出来的结果不好。9 Z. w8 n7 v: |- k' Z; e7 P
我们是用0.1%胶原酶和0.05%透明质酸酶消化1.5小时。
请问有没有高人可以指点一下？. e- r) K. O# s9 S% Z6 A S5 _3 n) K
还有我想问透明质酸酶你们是用那一家的？( m, }! N3 v& g
谢谢各位的帮忙。

作者: andylee824 时间: 2011-9-15 13:55

我们都是用二型胶原酶（GIBCO） 0.05%，个人认为胶原酶浓度不要太高，对细胞伤害太大；还有脐带要充分剪碎，过夜就可以了。不用透明质酸酶

作者: 1301918986 时间: 2011-9-16 08:53

回复 andylee824 的帖子

你好，请教一下，我们用二型胶原酶消化过一次，消化过后感觉脐带都消得差不多了，结果液体太粘稠了，根本离心不出来细胞，不知道是什么问题？

作者: dragon513 时间: 2011-9-16 08:57

胰酶和二型胶原酶消化更多点，有单用一种也有两种合用的。胰酶浓度不能太大，作用时间太长对细胞伤害挺大，胶酶伤细胞似乎作用不大。

作者: andylee824 时间: 2011-9-16 08:59

你说的“液体太粘稠了”，我知道什么意思了。消化后的液体，应该先用10倍体积的盐水稀释，充分洗涤。然后离心，2500 rpm,15 min.最后合为一管种瓶。你试试这个方法。

作者: hwlightning 时间: 2011-9-16 11:32

我之前也是用胶原酶和透明质酸酶，结果也很不理想' A. k3 e- A# Q
后面我用组织贴壁法效果很好，细胞也挺纯，可能培养时间较消化长些，但是比较简单。可以试试。

作者: leungyk 时间: 2011-9-16 14:29

tkpss18 发表于 2011-9-15 11:44 * {/ ], ]6 P! H3 _/ A) O( W
请问有没有人是用透明质酸酶和胶原酶来做脐带消化的？
# W; b; _7 R. u+ ?8 t我们实验室的实验做出来的结果不好。; `4 j9 J$ Q3 O* {6 d$ ^; b6 [
我们是用0.1% ...

( E( E: I" n3 a; @* T A5 }
跟我們有聯繫的另一組人，他們是用胶原酶和透明质酸酶的，不過是分開消化
首先最0.1%胶原酶1個小時 (棄掉)，然後再用透明质酸酶(sigma)
他們的結果理想

而我們，最近試了不同濃度的胶原酶(0.05%/0.1%/0.2%)，不同時間 (0.5/1/1.5/2 小時) ，初步結果: 全部都有MSC長出
& F+ Z! M, N- i% z7 z+ s

作者: 300000 时间: 2011-9-16 15:36

谢谢各位大侠、学习了。个人建议还是不要消化，获得细胞数量较少。用贴块法较好。

作者: tangyvhuang 时间: 2011-9-17 16:47

我用混合酶消化的，效果很好的，楼主的比例是多少？就是组织跟消化酶的比例是多少?1:1还是1：2还是什么的？不管比例是多少，只要组织处理的足够碎，基本上都能消化的一点不剩。1.5h的话要是比例大的话也没问题也能消化干净，我为了省酶，基本上那个1：1,四五个小时吧。% y `/ ^( O6 p
楼上的那个单纯用胶原酶的老兄，单一的酶消化之后，消化液肯定很粘稠的，离心离不出东西。一种方法就是大量稀释，10-20倍ns稀释后离心，另外一种就是加入其他酶。透明质酸酶是一种降低细胞间质的粘性的酶，中性蛋白酶是讲解胶原蛋白的一种酶，这两个酶都是降低粘性的，

作者: tkpss18 时间: 2011-9-22 16:49

谢谢各位提供的宝贵意见。
我用的比例是1:1的。可能跟楼上说的一样。。重点是要把脐带剪碎。
透明质酸酶用后是真的有效改善粘性的情况发生。
那我想问一下，消化完以后你们是用牛血清来停止消化然后再离心的吗？
谢谢~

作者: lidaifu001 时间: 2011-9-23 09:01

leungyk 发表于 2011-9-16 14:29 . K3 D' ?! L! t; c8 r$ f7 s
跟我們有聯繫的另一組人，他們是用胶原酶和透明质酸酶的，不過是分開消化
& m! ^0 J# I1 ^8 ^* P首先最0.1%胶原酶1個小時 (棄掉 ...

5 _1 A% `+ Z7 U; C8 Z3 P
您说的对，提问者之所以结果不好，是因为胶原酶和透明质酸酶不能同时用，而是现用胶原酶消化后，在用透明质酸酶去粘的。

作者: Tonypan 时间: 2011-9-24 00:56

细胞比较粘稠很多时候是处理细胞时DNA泄露出来了。用100u/ml DNase处理（注意一下DNase激活条件）会好很多

作者: meister 时间: 2011-10-9 10:11

粘性不是DNA引起的
透明质酸酶使用应该后用6 h0 g% }. X4 o* ~# g) G5 o& t2 W
胶原酶对细胞损伤小，可以消化时间延长

作者: havie 时间: 2011-10-10 20:58

细胞液粘稠是DNA泄露引起的，用DNaseI处理即可% I) a, j7 v/ d" f% u$ D6 D. O6 Y
另外，消化脐带我们使用的是一型胶原酶

作者: 细胞干 时间: 2012-2-22 20:36

偶用0.1%胶原酶消化40min，然后加0.25%胰酶继续消化30min，貌似效果不好啊，消化完液体很粘稠，很难过滤。, N8 Z! s9 ^5 `
能不能增加胰酶浓度或延长胰酶消化时间啊？

作者: 相文 时间: 2012-3-10 22:01

透明质酸酶消化的时间是多长啊？浓度是多大啊？我怎么老做不出来，还有这些的ph要调吗？用什么调啊？

作者: 上帝帮我转运吧 时间: 2012-3-12 10:06

回复 andylee824 的帖子! F; x, z! n7 F( J

您好，我曾用2型胶原酶过夜（16h），组织全溶了，后来就四倍稀释离心。接种后也有贴壁变形的细胞，但是感觉很饥饿的样子，很细长，后来就不怎么长。我开始感觉是培养基的问题，后来发现用组织法做的就不是这个样子。我想问您那过夜是多长时间？组织都溶了吗？稀释几倍离心？有过滤吗？谢谢，多给新手指教

作者: andylee824 时间: 2012-3-12 10:35

过夜是不超过12小时；一般情况下，如果你剪的足够碎的话，会全溶解的；稀释10倍离心；用筛网过滤后种瓶。

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