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标题: 最近在养人的真皮成纤维细胞,但是整个过程未见单个细胞,请各位战友帮我分析一下原因 [打印本页]

作者: ujj_hong 时间: 2012-3-13 15:03 标题: 最近在养人的真皮成纤维细胞,但是整个过程未见单个细胞,请各位战友帮我分析一下原因

我最近在养人的真皮成纤维细胞,但是整个过程未见单个细胞,请各位战友帮我分析一下原因.我的具体方法是:. U" S  T3 ^3 P0 l
(1)将皮肤置于75%的酒精中消毒1min;
(2)将皮肤置于双抗中浸泡30min;. f) [  |( c) [2 }' y
(3)配置浓度为0.2%的DispaseⅡ酶,将皮肤剪成2×5mm的条状,放入酶中,4度作用17小时;7 q" g) S3 ?' g! q8 M3 Z
(4)将真皮和表皮用镊子分离;
(5)将真皮组织用眼科剪刀剪碎,平铺在培养瓶中,倒置,加入3mL培养基(DMEM培养基+15%胎牛血清),3小时后,轻轻翻转培养瓶培养;培养了5天后仍未见有细胞爬出. 显微镜下观察只是看到很多线团,像头发一样粗细,没有单个的细胞.# A4 t  b( X6 F
(6)另外我还做了一组对照,将真皮组织用胶原酶消化,动态观察消化的整个过程,但奇怪的是,整个过程中没有观察到单个细胞7 }6 U$ x" b! A* K2 G! K$ o
请各位战友帮我分析一下这是什么情况,为什么整个过程都没有单个细胞出现呢?谢谢!

作者: ujj_hong 时间: 2012-3-13 15:09

另外想请问一下,标本拿回来后因为不能及时进行实验,所以将标本直接放到液氮中去了,不知道这样是否也会影响细胞的活力?

作者: chongziqiong 时间: 2012-3-14 10:35

取来的新鲜标本最好马上就做，年轻的可以在培养基里4°放置一天，年龄偏大的最好当天就做。我一般取来标本后碘酒、酒精、加双抗的PBS依次浸泡后，要用手术刀把多余的脂肪层刮掉（越干净越好），4°消化过夜，后分离表皮层和真皮层。然后把真皮切成2mm左右的小方块，然后真皮层朝下，贴到培养皿里。加入培养液，培养就好了，一般3-4d就会有细胞爬出啦。

作者: chongziqiong 时间: 2012-3-14 10:36

作者: chongziqiong 时间: 2012-3-14 10:42

这是我养的爬片，希望对你有帮助

作者: 干细胞谷 时间: 2012-3-14 10:49

标本直接放液氮肯定不行，细胞会全死的。

作者: houbara 时间: 2012-3-14 12:28

组织块上面压一个盖玻片，效果不错

作者: SKC-SFC 时间: 2012-3-14 13:52

首先我想说的是，是真皮成纤维细胞这个说法是否正确呢？是不是真皮间充质细胞或者真皮成纤维样细胞更合适呢？然后如果是培养真皮的细胞是否需要将表皮和真皮分开呢？好分否？个人观点：皮肤看似很容易培养，其实很多外在因素会决定是否可以培养出来。比如是否新鲜。是否被压坏，是否被污染。

作者: 300000 时间: 2012-3-25 11:47

个人认为可以再等等，不行的话，可以缩短胶原酶的消化时间。

作者: bin 时间: 2012-5-22 10:57

回复 ujj_hong 的帖子( K }- |" R1 z+ r/ g

你直接把标本放到液氮里，细胞可能已经死了，这样你当然得不到细胞了。标本一定要新鲜的

作者: bin 时间: 2012-5-22 10:58

回复 chongziqiong 的帖子
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你这是什么组织呀，几天以后的，用什么培养基？

作者: youzi821 时间: 2012-6-25 16:22

细胞冻存在液氮是要加DMSO或甘油的，你这个直接把组织细胞放到液氮，你还想养出细胞来，肯定不行啊！！

作者: yooicelili 时间: 2012-7-10 23:37

用胶原酶消化真皮组织，会得到大量的真皮成纤维细胞，第二天就可以收到很多细胞。

作者: xyybetter 时间: 2012-9-11 11:18

回复 chongziqiong 的帖子

请问碘酒，酒精，双抗分别泡多久？消化皮肤时用的是那种酶？谢谢

作者: receiver1 时间: 2012-9-19 12:09

你没有得到细胞的原因，是因为你把材料放到液氮里了。没有经过标准化的冻存程序，细胞很难存活，即使是在组织中。另外，你消化了17小时，感觉也挺长的。我们一般头天下午或晚上消化上，第二天上午就处理了。下次你用新鲜的皮肤材料吧。

作者: 金刚石（书记） 时间: 2012-11-4 16:11

标本放液氮细胞肯定都死了，取回标本若不能及时做，可加培养基放于4度冰箱，但一定要尽快做，放几个小时还是可以的。$ v9 f% b, `5 _( k
然后标本剪除皮下脂肪组织等后剪成小块放中性蛋白酶4度过夜，分离表真皮，真皮侧剪碎后再用胰酶37度消化5-10分钟，含血清培养基终止消化后过滤网，将滤液离心后接种即可。当然分离表真皮后也可直接将真皮侧放入培养瓶培养组织块几天即有细胞爬出。祝成功。

作者: 金刚石（书记） 时间: 2012-11-4 16:12

标本放液氮细胞肯定都死了，取回标本若不能及时做，可加培养基放于4度冰箱，但一定要尽快做，放几个小时还是可以的。8 ?* A2 w$ _" w6 |& S' F
然后标本剪除皮下脂肪组织等后剪成小块放中性蛋白酶4度过夜，分离表真皮，真皮侧剪碎后再用胰酶37度消化5-10分钟，含血清培养基终止消化后过滤网，将滤液离心后接种即可。当然分离表真皮后也可直接将真皮侧放入培养瓶培养组织块几天即有细胞爬出。祝成功。

作者: sadieshen 时间: 2012-11-19 22:45

肯定不能放液氮阿，直接都死了。。。我是分了表皮和真皮后，把真皮剪碎，胶原酶消化至没有肉眼可见小块，离心，洗涤，加培液直接铺板，第3天就很满了。

作者: chongziqiong 时间: 2012-12-12 22:06

回复 bin 的帖子
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人的真皮，7天左右，普通的高糖DMEM+FBS

作者: chongziqiong 时间: 2012-12-12 22:07

回复 xyybetter 的帖子9 _+ I$ h7 r a! g- W( V1 Q( X: l
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碘酒1-2min，酒精是脱碘的时间不用很长，双抗PBS可以多洗
消化皮肤？你问的是皮肤层消化开还是表皮还是真皮？

作者: chenlin080102 时间: 2015-4-18 15:10

我也刚学分离成纤维细胞的分离，还没爬出来

作者: cellcellcell 时间: 2016-4-12 15:36

首先，标本拿回来放到液氮里会影响到细胞的活性，这也可能是导致培养时间偏长的原因，可以再等等看。另外，你所提到的像头发团一样的东西，到底是不是因为被污染了呢？如果被污染的话，微生物争夺了细胞的营养物质，这也是培养不出来结果的原因。

作者: 羽毛笔 时间: 2018-5-21 09:14

我也遇到相同的问题，组织培养法和酶消化法一周多都没有看到一个细胞，我们没有液氮冻存，但是常温放置了2h（去别的医院拿回来路上耽搁了），瘢痕组织我们只去除了表皮，皮下脂肪基本没处理，剪碎后根本分不清哪面是真皮，就是一坨一坨的小组织，铺在了细胞培养皿上，显微镜下看着像头发团一样。也找不到原因，希望大神帮忙分析一下，怎么一个细胞都没有呢，酶消化法细胞过完筛后立即在显微镜下观察，也没有看到细胞，想不通。

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