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标题: 求助：我的CIK怎么了？ [打印本页]

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-11-28 16:35 标题: 求助：我的CIK怎么了？

   最近养CIK连续一周了，分血后细胞计数存有大量黑色小点，反光，个人怀疑是血小板。培养几天后，有的瓶子，黑点越来越多，贴壁居多。四五天后，贴壁主要是黑点，养的CIK细胞死的很多，扩增很少。请问谁知道怎么回事啊？
  分血了8份血了，都有这个情况。是个人操作吗？  那为啥以前没有呢？还有最近发现离心机离心后，就是吸白膜层的时候，发现白膜层下的FICOLL是红色的，以前一直是白色的。是FICOLL的原因吗，最近用的是新批号的。) O$ h5 K. n* O$ I$ [


具体描述黑点：细胞计数时，不是用台酚蓝染色吗，绝大数CIK细胞体积较大，但是其间存有少量体积小的也是很亮的细胞。当混悬细胞培养时，在奥林巴斯倒置显微镜下观察，10乘20倍像素下观察，显黑色，但是调节粗螺旋和西螺旋观看，可发现黑点也反光。做了各项物质的内毒和革兰氏检测，无菌也做了，都没问题？
原因何在啊？
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  元芳，此事你怎么看？

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-11-28 16:40

顺便提一句，11月14日，本人清理了一下孵化箱，用纯化水加苯扎溴铵，清洗了一下孵化箱，于是从11月15日，噩梦开始。! n4 m% K# H1 X% e7 g$ G) B. O' ?
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后来于11月22日，又重新清理了一下孵化箱，27号分血，今天28号观察还是有，可是有意思的是，一瓶多点，开始贴壁，一瓶很少。顺便说一下，先头分血的，有的丢了，有的加因子处理，扩瓶了，后来细胞长起来的，黑点越来越少；而黑点多的，现在细胞很少，瓶底成了黑色的海洋。

作者: mkhorse 时间: 2012-11-29 09:37

发图片上来看看

作者: bloodroses 时间: 2012-11-30 11:47

白膜层下面的ficoll成红色，如果每份血都成红色，应该是分离液的问题，如果个别血样成红色，应该是样本差异的问题。

作者: kiss2346 时间: 2012-11-30 15:33

白膜层下的FICOLL呈红色，估计分离液有问题的可能性比较大，可以适当提高离心速度，或者铺平面的时候多分出来几管试试。
我想知道你的CIK做法，在单个核分离前是否进行血浆分离？分离结束后是否进行贴壁分离DC与CIK？是把单个核细胞分离后直接按照CIK的方法养的？$ F8 T- L: R8 [
我感觉你说的嘿嘿的东西是血小板，可以试试先进行血浆分离再做。
我不是很确定所以仅供参考

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-12-7 16:58

回复 kiss2346 的帖子

最近一直挺忙的，首先，我的CIK是分离血浆的；第二，分离后进行贴壁分离DC\CIK；第三，我们提高离心速度后，分离液又变的透明了，查看了厂家FICOLL的说明书后，大致可以推测可能是气候原因，天气冷了，GMP车间内温度最近一直在20度以下。5 F% W" B- O# [7 r% `. P
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再提高离心速度后，分血依然存在黑黑的东西，手机拍不了照，郁闷。不过现在离心后，少了很多。有人说是血小板，有人说是细胞碎片，有人说是粒细胞。

镜下观察，在4×10下观察，与透亮的细胞相比，小很多，呈黑色颗粒，观察有悬浮的，不过绝大多数贴壁。在40×10观察下，调节粗细螺旋，可以发现，这种物质呈绿豆样，在一定角度下，也反光，透亮。

元芳，你怎么看?

作者: kiss2346 时间: 2013-1-7 08:50

回复突击兵之小土豆的帖子
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你每次做培养之前不会用计数仪进行计数么？最近每次做的时候在正常要进行贴壁培养的时候，再添加一步1200/10min的离心，能够较好的去掉血小板，如果不放心可以再加一步。看看效果，感觉一下是什么东西在里面。还有一种可能那些东西是红细胞，不过红细胞在培养一段时间之后一般会自行裂解，不过有红细胞和血小板的细胞在初期看的时候培养液都会非常脏，一直有各种各样的碎片在里面。这个还是要你自己去判断了，天气变冷适当调节一点条件试试吧

作者: kiss2346 时间: 2013-1-7 08:51

还有最好是在培养前进行一下计数用仪器。。。。这样可以初步判断血小板的量红细胞的量还有你分离结束后分离出来的细胞沉淀是不是红的？还是白的？如果是红的真的很有可能是红细胞在里面。

作者: ljl1988115 时间: 2013-2-26 11:18

你在培养过程中是否加了血清，有没有可能是黑胶虫

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