干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 病毒感染细胞没有荧光，但检测有外源基因的表达 [打印本页]

作者: jiaocuihua123 时间: 2013-3-14 10:17 标题: 病毒感染细胞没有荧光，但检测有外源基因的表达

我用pLM慢病毒载体，转染293ft细胞生产病毒，然后用其感染细胞，但是没有荧光，然后提取细胞RNA，反转录，经行PCR，发现有外源基因的表达，请问为什么会没有荧光呢，是载体出了问题吗，请大家指教。

作者: misser217 时间: 2013-5-12 21:39

同问……

作者: sizhengliu 时间: 2013-5-14 20:11

你的gfp序列是在目的基因序列后，还是前？

作者: daviddow 时间: 2013-5-19 08:49

我也遇到这种问题，既然有表达了就下续试验吧。可能和你载体有关，不是大公司的载体，可能就存在这种问题。

作者: jiaocuihua123 时间: 2013-5-23 11:21

回复 sizhengliu 的帖子- ^+ p" B- K, D( X/ l4 F

是在目的基因之后,用2A连在一起的,谢谢.

作者: jiaocuihua123 时间: 2013-5-23 11:26

回复 daviddow 的帖子

嗯,但是想用阳性的细胞做克隆,所以没有荧光的话没法保证阳性率,只能是盲做.所以很麻烦,是不是载体变异了呢?

作者: jiaocuihua123 时间: 2013-5-23 12:38

回复 sizhengliu 的帖子

不好意思,我记错了,荧光序列是在目的系列之前,通过P2A相连.谢谢.

作者: sizhengliu 时间: 2013-6-12 21:08

回复 jiaocuihua123 的帖子
& S: s/ e; C) }* e
这就可以解释了，部分载体只表达了目地序列，到gfp序列时表达已经很弱，因此，你观察不到

作者: neuralstem 时间: 2013-9-12 02:47

用抗体染一下可能就看见GFP了# O* c0 U4 Y1 P: o

作者: prophe 时间: 2013-9-12 08:14

本帖最后由 prophe 于 2013-9-12 08:15 编辑
' o4 m) t/ Z' c1 Y
也有可能目的基因在细胞有本底表达，建议做一个不感染的作对照。

作者: jiaocuihua123 时间: 2013-10-9 10:06

回复 sizhengliu 的帖子# v2 q6 d3 _1 D% |

恩，估计是吧，再到网站上查的时候已经查不到质粒信息啦，被骗了呀

作者: jiaocuihua123 时间: 2013-10-9 10:06

回复 prophe 的帖子$ o; N! [$ u' j7 {; P+ r/ V
) Y9 f+ ?6 h# B: A0 w
做了，不感染的确实没有外源基因的表达

作者: 三木一叶 时间: 2015-5-25 21:16

回复 neuralstem 的帖子# m1 ~' Q. Z# H

抗体染一下是啥意思呢？做western？还是加抗体到培养基里面去诱导一下？

作者: 三木一叶 时间: 2015-7-2 20:45

定量出来的数据，你没有一个对照样品，毫无意义。你应该做一个anti－gfp 的wb，看看蛋白有没有表达。

作者: zmfang555 时间: 2016-2-23 14:52

GFP有可能表达了，但是弱阳性，另外RT你做阴性对照没有？也可能是本底。

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)