跑胶出现三条带？

gxbzjznn

P基因跑胶SOX2居然出现三条带？大家帮我分析一下我的这张电泳图毛病（任何毛病的地方都可以），欢迎批评指导

nichifanlema2

回复 gxbzjznn 的帖子3 f3 J2 V8 J- O
. n& x. a1 I) \; I, C5 _
引物二聚体的出现不一定会出现在每次扩增和其它基因的扩增中，其跟引物的设计有关。个人认为，在基因扩增时，引物的都是过量的，如果两对引物直接有4个（含）以上的碱基配对，引物二聚体就常常会出现，在不影响基因扩增和表达趋势的情况下，可以忽略不计。通常使用时的引物浓度为10uM,如果引物二聚体较为明显，或者影响了扩增，可以适当降低引物浓度。另外，为了提高扩增效率和扩增时的特异性，可以提高退火温度。

云飘过的思念

$ ?6 n) p4 _+ K& w- o& h7 X( X

gxbzjznn 发表于 2016-1-13 22:38
7 f) U4 Q2 _! W回复 nichifanlema2 的帖子
9 a9 d" [! p; a% }/ _# B. Z7 v; ^
0 ?8 Y# r: _; d/ F6 u' p% t0 s我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水 ...

/ M' ?) Y& L% F2 P! B

2 ?" C6 U" E& e! m& D, t/ n我们之前溶解引物的方法如下，仅供参考$ c, Y  d* G$ m! _) {" a: |, G  b
实测浓度（ng/ul）=实测260值*33*稀释倍数
! _6 T$ N2 ]) F5 T8 r/ U; n6 e实际浓度（uM）= 实测浓度（ng/ul）*1000/M.W. f9 I  H# \. x) ~5 D  c8 [6 E
补水量（ul）= 实际浓度（uM）*（总体积-测OD消耗体积）/定溶浓度（uM）- （总体积-测OD消耗体积）
) S, b; g; X2 I. U: ]
0 u# H$ y2 p5 U. Y( g7 B定量设备为NanoDorp2000

云飘过的思念

7 f) Q$ E  x- j3 W4 n. Z. n. ]$ T. M, ?5 _. ^; c  x
回复 gxbzjznn 的帖子! i: {: m$ C, [( h# J' H

! v; m& k1 D4 f恩，具体染料可以分很多种，只要能在特定波长激发光下发光即可，但是染色方法是胶染哈，嘿嘿

gxbzjznn

回复 nichifanlema2 的帖子0 T$ U9 C6 X7 J7 F; H( m

  |7 U* p4 N* E我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水稀释十倍的 （取10ul到另一个新的1.5ml离心管再加90ul无酶水） ！  这样浓度还大的话该怎么稀释呢？你们一般都是怎么稀释引物呢？

gxbzjznn

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) z# C% z8 J1 W% ~6 o* c3 {, @5 J: H3 t9 k( U9 K! N3 t4 k7 _' M
我们用核酸染料是Gelview

gxbzjznn

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! b  p5 b* E( `2 H8 o  T1 ~, V' f2 g- g+ ^
不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢

gxbzjznn

回复 nichifanlema2 的帖子2 t$ O0 k2 D: b# |2 {

- [0 j3 B' K5 U  g' M, FTakara

gxbzjznn

回复 thinktank 的帖子* \3 b! E, C9 B
- I/ o  W  D& s1 A% h% y4 B4 u
不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢

gxbzjznn

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; V) f2 j$ B. `& {$ N
我也觉得中间是引物二聚体 但是我做的其他基因就没有这种情况