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干细胞和药物开发：新时代的开始？
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Lee L. Rubin6 f5 i1 j; b+ P' ^) q
. L" R, I9 A8 M; A* e. ~. ]Cell 132, 549-552, February 22, 2008
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1 U) ]/ R ^7 f2 F: j( f. h' r8 A 虽然对干细胞的注意力大都集中在干细胞在细胞置换治疗中的作用，但是干细胞也有可能改变开发高效治疗方法的模式。
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4 U0 k# z; U( o导论
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药物的失败率极高，在临床测试的药物有90%以上不能通过测试，这是医疗体系的一大负担。药物在临床试验后期甚至在试验通过后的失败或者是因为缺少足够的疗效或者是有意料之外的毒性。更多的药物是在研发过程的早期就遭到失败。通过使用更真实代表人类疾病的模型，从而更好地理解疾病基本机制，可在多大程度上解决这种无效、昂贵的药物开发难题？理论上人胚胎干细胞(ES)可以很好地实现这一目标。可以从有特定疾病的患者中得到ES细胞，并开发使疾病专一性ES细胞成为受疾病影响的细胞系的方法。这种与疾病有关的细胞可以促进药物的开发以及药物毒性的研究。. V% N M1 a$ ~5 P7 g& x5 W' B7 ]
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重新编程（去分化）筛选
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在药物筛选过程中，有许多可以使用人ES细胞或使用从ES细胞产生的祖细胞的方法。第一步是分离ES细胞，这在小鼠中不成问题，但对人细胞来说较为困难并有争议。一些产生人ES细胞的技术包括人皮肤活体的体细胞核转移，以及使用在胚胎移植前经过遗传诊断的胚胎。最近诱导多能干细胞(iPS)的发明使产生人ES细胞变得更为简单。现在已可以从大量有特殊疾病的患者中制备ES细胞系。从筛选的角度看，选择使用原癌基因或病毒载体产生iPS细胞必然要寻找更换因子，即寻找能够全部或部分对分化的人细胞重新编程的小分子或蛋白质。1 x. A0 L; L% B% v; Z, C
7 l, Z8 z# u5 O- v 在有尾两栖动物中有许多关于去分化的研究（去分化可被看作是成熟细胞的部分重新编程）。有尾两栖动物可通过在受伤部位形成胚基，重新长出肢体。发生这种情况的部分原因是由于细胞化作用，即多细胞核肌管分裂成多功能单细胞核细胞。对两栖动物中去分化机制的理解有助于设计使哺乳动物成熟细胞重新编程的筛选。例如，对一个有几万个不同化合物的文库的筛选最终鉴定了一个称为肌基质蛋白的微管破裂分子。这种分子使小鼠C2C12肌管裂解成单细胞，该细胞保持某些亲代细胞的分化性质，如表达肌动蛋白重链。第二轮筛选产生了一个称为reversine的化合物，它能使成肌细胞重新编程成为间叶细胞干细胞，并能进一步分化成骨细胞和脂肪细胞。有趣的是，其他的化学修饰和用固相化合物进行的亲和层析表明reversine的细胞内基本标靶不止一个，包括结构上无相似之处的MEK1激酶和非肌肉肌动蛋白II重链。上述实验室用小鼠ES细胞进行的自我更新筛选发现了SCI，它也有与两个结构上不同的细胞内标靶结合的特殊性质。进一步了解这些成功的筛选是否依赖于对单一标靶无绝对专一性的文库化合物非常重要。! n8 X+ o) {6 x1 A, m3 u: p
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分化筛选（定向分化）+ P/ h7 y( ]/ ^ w& e0 j+ q
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去分化筛选或重新编程筛选从分化的细胞开始，目的是鉴定使分化细胞变为低度分化细胞的因子。但是，在大量制备与疾病有关的不同种类细胞时，一个主要的挑战是控制分化，即诱导干细胞或祖细胞使其有较多的分化。干细胞文献中有许多关于“全垒打”实验的描述，即用许多因子的混合物来处理ES细胞，以便使大量干细胞进行多个分化步骤，产生所需要的最终产物。最近的研究集中在更为合理的细胞诱导方法，使干细胞在组织培养环境中进行连续分化，从而可重现正常胚胎发育的步骤。例如，Tom Jessell等实验室在研究小鼠脊髓发育时展示了在发育过程中，通过控制对细胞外因子精密梯度起响应的特定转录因子的表达，可产生神经细胞专一性。每一种脊髓祖细胞的出现都是由一组特定的转录因子决定。Wichterle等在细胞培养物中成功地重复了这些实验。他们使用在运动神经元专一性启动子控制下表达绿色荧光蛋白(GFP)的小鼠ES细胞，使它们象胚状体(EB)一样生长。当用两个在运动神经元发育中很重要的因子处理EB时（先用维甲酸，再用Hedgehog信号传导活化因子），会出现表达GFP的有功能的运动神经元。9 F- E0 b3 Z$ j5 ?& O( d! i# ?
" k. J. a) `+ t: g: M 许多研究小组已尝试用ES细胞或祖细胞进行类似的研究。例如，McKay、Sasai和Studer的实验室使用在生物学上相关的可溶性因子的组合或产生这些因子的细胞系，取得了一些成功。但是这种系统方法并不总是有效。Andersson等无法从小鼠ES细胞产生中脑多巴胺能(DA)神经元，尽管他们基本上使用了Wichterie的方法（更改之处是包括使用DA神经元品系分化所必需的诱导物FGF8）。重要的是，他们可以通过在小鼠ES细胞中瞬时表达同源框转录因子Lmxla，然后加入相关细胞外因子，得到DA神经元。
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关键问题是怎样找出指导ES细胞分化的基本方法。用不同的化学筛选得到分化途径的每一步，使细胞完全分化过程中的步骤得到重复是很重要的。例如，小鼠ES细胞可以通过下列步骤分化成DA神经元：先使ES细胞进入神经祖细胞途径(Sox2+)，然后进入早期祖细胞途径(Raldh+, Otx2+)，再进入晚期DA神经元祖细胞途径(Lmxla+, Nurrl+)，最后成为DA神经元。ES细胞也可通过先用内胚层诱导(Sox17+)，然后经早期胰腺(Pdx-1+)、胰内分泌(Ngn3+)诱导，再用分泌胰岛素的成熟β细胞（胰岛素+）诱导，最终成为胰腺β细胞。重要的是必须有每个发育阶段各种转录因子或其他细胞专一性标记的知识，并要有可鉴定刺激每个分化步骤的分子的方法。
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, l6 J8 u/ d$ ^; v小分子指导的分化
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9 i, z F" \$ w# V2 @! d d 这种类型的顺序分化模式并不是从头到尾的完整分化过程。换句话说，还没有人使用过系列筛选，去鉴定能使ES细胞有效产生完全分化的细胞的小分子。但是许多实验室已鉴定出至少能刺激部分分化的因子。例如，Ding等曾用表达微管蛋白α1—荧光素酶的小鼠P19胚胎肿瘤细胞作为神经分化的报告物，筛选含有各种小分子的庞大文库。他们的筛选得到了一个小分子—吡咯嘧啶。他们制备了吡咯嘧啶的类似物，并进一步鉴定了活性更高的化合物TSW119，合成了一个有效的亲和配基，最终鉴定出GSK-3β是这类神经元诱导分子的专一性结合蛋白。当然，TSW119也可能抑制其他激酶，而正是其他的激酶，或GSK-3β与一个或多个其他激酶的组合，调节神经细胞的产生。但是由于GSK-3β确实是Wnt信号传导的负调节因子，上述结果产生了Wnt途径（它是GSK-3β活性的调节因子之一）控制神经分化的可能性。有几项研究指出Wnt信号传导途径参与ES细胞自我更新和分化，但结果并不完全一致。
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已有人进行了若干概念上与上述筛选类似的筛选。例如，有人用表达位于心钠素启动子下游的荧光素酶的P19胚胎肿瘤细胞对含有100000个化合物的文库进行筛选，寻找心肌细胞的诱导物。从这种筛选中得到了一个二氨基嘧啶cardiogenol，它可诱导心细胞系的多个标记的表达。这个小分子的标靶尚未得到鉴定。对小分子混合文库进行的骨分化筛选是寻找在多分化潜能10T1/2成纤维细胞中碱性磷酸酶活性的增加。从这种筛选得到的产物再经化学方法制备类似物，结果得到了一个称为purmorphamine的分子，进一步的实验证明这是一个Hedgehog途径的拮抗剂。5 P8 ~; S6 q! B2 B* k2 G
9 [ l& q1 t, l* M" F e. ~4 d0 d 这些筛选都对含有多种小分子的文库进行大规模测试，并使用酶作为测试报告物。文库化合物的组合与制药公司常用的化合物组合类似。尽管这类研究提供了某些重要的化合物和观察，但从这些化合物筛选得到的产物并不能直接给出有关化合物标靶或反应机制的信息，需要有后续的化学研究。这对许多不能得到多种高质量化合物的研究人员或对不具备从初级筛选产物进一步开展特定化学研究的条件的科研人员来说，是一个难题。; D h' D! K; ?" p& W
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为了找到诱导细胞分化的分子，可考虑使用其他类型化合物文库。例如，许多研究机构的实验室已开始筛选所谓“生物活性”化合物组合，这些组合主要是药物和有药理活性的试剂。这些由1500—5000个化合物组成的小组合之所以被广泛使用出于几个原因。一个原因是在对翻译研究感兴趣的科研小组中，最近开始对新用途药物（寻找已有药物的新用途）感兴趣，因为这可以加速鉴定罕见疾病的治疗方法。但是对于分化筛选而言，使用这些文库还有其他优点。这些“生物活性”化合物组合较容易得到，在符合要求的条件下，筛选得到的产物可以是实验室中诱导细胞分化的可用试剂，不需要有进一步的化学操作。另外，诱导特定分化步骤的分子种类可以提供作用机制的信息。例如，如果在一个特定的细胞分化测定中鉴定了几个不同的钙通道阻断物，可根据这些不同的阻断物进行几个不同的实验。Saxe等在神经生成测定中进行了生物活性筛选。他们使用了从大鼠胚胎脑制备的初级神经细胞体，并使用化学发光法测定可增加βIII微管蛋白（一种神经元标记）总量的化合物。他们从筛选中得到的一个产物是orphan配基L-丝氨酸-O-磷酸，它可通过与代谢型谷氨酸受体结合，刺激分化。Diamandis等为了寻找神经干细胞增殖的抑制剂，测试了一个不同的生物活性化合物的小型组合，他们使用间接的标准MTT测定进行抑制剂的检测。这些研究人员观察到，几种不同神经递质受体的拮抗剂和反拮抗剂是抑制增殖的因子（有趣的是，这些因子对脑肿瘤干细胞也有抑制有丝分裂的类似作用）。/ p6 M& Y) q& ?6 a. P' H
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对分化测定来说另一组值得考虑的“搅动因子”包括形态发生素、某些蛋白诱导物和底物以及细胞结合因子。胚胎发育主要是由少数活化配基的信号传导途径进行调节，包括TGF-β/BMP、FGF、Wnt、Notch和Hedgehog的信号传导途径。开发小规模（无机器人）分化方法的研究人员通常测试几个上述蛋白因子，而使用机器人筛选步骤的研究人员一般集中在非蛋白质的小分子上，这一点很令人惊讶，因为尽管活化的信号传导途径数量很小，但胚胎信号传导的环境需要有在正确时间、以适当的量以及与其他因子恰当组合的每一种相关配基，以便有高度专一性的细胞分化。对这些配基的浓度和组合的正确选择可能会极大增加分化的效率。这个问题可以通过机器人筛选得到妥善解决，因为这种筛选可以恰当地测试这些蛋白因子的各种组合。
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! _( w$ m. p+ S4 |3 d 有几个研究人员使未分化的细胞在少数诱导细胞系或培养细胞系上或在细胞外基质上生长，也得到很好的效果，但底物结合的可溶性因子的组合测定的优点只是在最近才受到关注。Flaim测定了细胞外基质的组合（在该测定中使用相同的细胞培养基）对小鼠ES细胞分化形成肝细胞的能力的影响，发现在各种组合之间有很大的不同。Soen等研究了在有各种组合的基质组分以及形态发生素的底物上生长的人初级前体神经细胞的微阵列。他们发现在不同的条件下，细胞成为神经元或成为神经胶质细胞的取向有很大不同。因此一个巧妙的构想是在顺序分化测定中，用某些小分子一起综合性地寻找这些类型的蛋白因子。一旦有适当的试剂，其他类型的筛选，如siRNA测定和ORFeome筛选也会兴起，而筛选这些文库的应用价值早已得到证实。* e E4 I9 M9 i" ]* d8 d+ p7 J7 P( q
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另一项考虑到细胞分化测定方式的议题也值得讨论。目前进行的大多数分化测定都是群体研究。在这类研究中，测定每个测定孔中的荧光素酶活性或单个蛋白标记的总量。在某种意义上这些研究在概念上与工业标准高通量测定类似，通常以无细胞形式（如酶测定）进行，但是要有通常在制药公司或生物技术公司进行测试时需要的大量测定和多种化合物。目前在研究机构和工业界都开始广泛使用的一个不同的方法是高含量分析或基于显微镜的分析。这类可以自动化的测定可给出各类细胞的多种性质，非常适用于进行不均一细胞群体的分化研究。例如，通过荧光蛋白或抗体标记计算表达相关标记的细胞数目，从而检测出在分化筛选中的较不明显的产物。此外，可使用多个标记，得到每个细胞的定量数据。高含量分析也能揭示特定化合物是否有毒性，或是否引起细胞形状的改变，例如神经细胞的加工延伸或由于细胞收缩造成的假阳性。由此看来，高含量筛选在调节细胞分化中可起重要作用。当这种方法与生物学或医学相关的细胞结合使用时，可能会提供很多新的治疗方法。
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8 `. Q$ G4 Q7 |疾病机制和毒性
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当从小鼠或人ES细胞产生所有类型的分化细胞成为可能时，实施多种实验便成为可能。在许多疾病中，某些种类的细胞比另外一些类型的细胞受到更大影响。例如，在脊髓性肌肉萎缩症(SMA)和肌萎缩侧索硬化症(ALS)中，运动神经元退化；在亨廷顿舞蹈病中，纹状体棘状神经元死亡；在帕金森症中，黑质的一部分DA神经元丢失。但老年痴呆症等神经元全面退化疾病，对某些细胞群体（如内嗅皮质神经元）的影响比对其他细胞的影响大。不同的细胞有不同的疾病敏感性在SMA和亨廷顿症中令人困惑，因为这些遗传疾病使所有的细胞都有同样的突变。握有正确分化的神经元对全面理解上述疾病（包括非家族性、不规律发生的ALS）中的选择性细胞死亡会有很大帮助。
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6 \+ ]" \( | _0 E7 A7 p+ ? 已有可能从ES细胞制备大量神经元，对疾病机制的研究正在进行。Di Giorgio等培养了从ALS小鼠模型分离的ES细胞中产生的运动神经元，结果显示了这些运动神经元的死亡速度比从正常小鼠ES细胞衍生的运动神经元的死亡速度快。在与从相同小鼠的星细胞一同培养时，这种神经元的死亡速度更快。! g8 ^ e! @7 T$ J6 U0 v
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星细胞诱导的从突变ES细胞产生的运动神经元的死亡可以用于旨在发现增加存活的化合物的大规模筛选。我的实验室已从小鼠SMA模型中分离了ES细胞，将其诱导分化成大量运动神经元，目前正在进行高含量筛选，以便鉴定使运动神经元存活延长的药物。目前大多数SMA研究是对表型正常的成纤维细胞进行研究，重要的是测定是否在运动神经元中的筛选有更好的治疗药物前景。这类方法的总体目标是研究在退化性疾病中受到影响的细胞的病理机制。# P0 `+ j8 @9 `" x) z# X* k, ^
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大多数药理学家认为在临床前的测试中缺乏毒理学预测，是有效开发新药物的一大难题。消除确实具有肝脏毒性和心脏毒性的铅化合物特别令人关注。从大量有代表性的人群中产生ES细胞的能力以及掌握使这些ES细胞分化成肝细胞和心肌细胞的有效方法，可以为分析某些药物代谢以及测定可能有的副作用提供简便的测定方法。关键问题是在分化的ES细胞可真实地代表成熟细胞之前，要有多大程度的分化。: N8 ]0 S" U; p& A1 z9 q
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从大量病人中制造疾病专一性的人ES细胞系的构想在目前是很现实的。运用发育生物学的基本原理，可以设计出使用在不同分化阶段的各种ES衍生的细胞的筛选，使疾病模型更真实。这些基于干细胞的筛选可为不同治疗方法的发现和测试提供更有效、更可预测的方法。
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- m W& h- w0 ~本文转自建人先生原创，感谢 |
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发表于 2009-4-28 21:46
发表于 2009-5-29 10:13
