刷屏的张锋团队 CRISPR 重磅新应用缘何如此厉害？背后竟有诺奖级技术的支持！

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刷屏的张锋团队 CRISPR 重磅新应用缘何如此厉害？背后竟有诺奖级技术的支持！
: ]! ]; |( a) M; [% x来源:奇点网 / 作者:应雨妍 / 2017-04-20
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今天，华人科学家张锋大神又刷屏了。他和 James Collins 教授团队，联合将 CRISPR-Cas13a 改造成了灵敏度达到了阿摩尔级（aM，10 的负 18 次方摩尔每升），可以检测单分子的 SHERLOCK 技术。这一重要成果刊登在今天的《科学》杂志上 [1]。, s0 J' p' q, n8 P2 v- V" F3 U

  d% ^6 [% y  S就在大家在为张锋大神欢呼雀跃，在为 CRISPR-Cas13a 叫好的时候。我们发现，让 SHERLOCK 技术达到阿摩尔级灵敏度的不是 CRISPR-Cas13a，是它的搭档，另一个颠覆性的发明重组聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）。很少有报道提起她，她就那样默默站在 CRISPR-Cas13a 背后。) ?' F) U; L* A, w2 o: u
RPA 有多厉害？据说可以媲美 PCR 技术。什么是 PCR？著名发明家 Kary Mullis 因为发明这个技术于 1993 年获得诺贝尔奖……据了解 RPA 技术是由英国科技公司 TwistDx 发明的，发明人是 Niall A. Armes 和 Derek L. Stemple。如果张锋和 Collins 教授的这项发明最终能造福人类，我们也应该记住 RPA 的发明人。接下来我们就看看 RPA 和 CRISPR-Cas13a 联手，如何铸就 SHERLOCK 技术的。
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Jennifer Doudna 教授
2 t' D  D( b. G& V2 VSHERLOCK 与我们特别熟悉的 CRISPR-Cas9 有本质上的区别，它使用的酶是 Cas13a。Cas9 靶向切割的是 DNA，而 Cas13a 靶向的则是 RNA；而且 Cas13a 是一个“奇怪而又疯狂”的酶，像 Cas9 在切割完特定片段后就会失活，但 Cas13a 则会像“吃了炫迈一样停不下来”，在切割了自己应该切割的 RNA 后，它还会继续去切割其他遇到的 RNA。
$ h3 I) x, Y4 {0 Q其实在去年的 6 月份，张锋教授就在《科学》杂志上介绍过这个可以在细菌细胞中切割特定 RNA 序列的“奇怪而又疯狂”的酶了 [2]。然而在面世仅仅三个月后，另一位在 CRISPR 基因编辑系统领域做出卓越贡献的“大神”就“找了个茬”，我想，大家应该已经猜到了，这位大神就是与张锋教授有着专利之争的，加州大学伯克利分校的 Jennifer Doudna 教授。Doudna 教授和她的同事在《自然》杂志上发表研究，他们对 Cas13a 的潜力进行了验证。结果显示，如果想要让 Cas13a 顺利地与特定 RNA 结合，样本中至少需要数百万 RNA 分子，因此，使用 Cas13a 其实是达不到许多基础研究和临床应用所需要的灵敏度的 [3]。
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初始的 Cas13a 和“进化”后的 SHERLOCK 灵敏度的对比8 ]3 [! H- A9 ^; ?0 l2 o* P
这样的 CRISPR-Cas13a 是不能被称为“SHERLOCK”的，那么张锋教授是如何让它“开挂般”提高灵敏度的呢？这还要感谢和张峰教授同在 Broad 研究所工作的，合成生物学领域的“大牛”——James Collins 教授，他同时也是这次报告的联合通讯作者。两位“大牛”携手，他们想到了一个“外援”—— RPA。常规的 PCR 也可以扩增特定 DNA 片段，提高灵敏度，但是 PCR 对温度的控制有很复杂的要求，要经历高温变性、低温复性还有中温延伸三个步骤。RPA 就不需要这么麻烦，它的反应需要三种在常温下有活性的酶，最适温度在 37-42℃之间，不需要变性过程，这样就大大加快了扩增的速度。再加上不需要温控设备，两者共同打造了真正便携式的快速 DNA 扩增技术。
7 }- ]* K+ H. }不仅方便快捷，RPA 更“迷人”的地方在于扩增量十分高，能够将痕量的核酸（尤其是 DNA）模板扩增到能够可以检测到的水平。痕量，顾名思义就是“该物质虽然存在，但只有‘痕迹’，无法用一般方法定量检测，通常含量＜0.1mg”，所以大家就知道 RPA 有多厉害了吧？利用它可以从单分子得到大约 1012 的扩增产物。而且 RPA 还不需要复杂的样品处理，及时环境限制，无法提取核酸，也难不倒它 [4]。
" F- S5 ?* V* w, N利用 RPA，在室温中，样品中 DNA 或 RNA 的含量就可以得到提升，一旦含量增加了，再将 DNA 转化为 RNA。如此，Cas13a 就有资格进化成“SHERLOCK”了！不过 SHERLOCK 其实是一个“团队”，研究人员给 Cas13a“配备”了两个助手：一个是引导它到达应该被切割的特异性 RNA 的“向导 RNA”；另一个叫做“报告 RNA”，因为 Cas13a 在切割完特定 RNA 后不会失活，所以在 Cas13a 完成任务开始“作乱”的时候，报告 RNA 就会被切断，发出荧光信号。研究人员们就知道，它已经找到了与其相匹配的 RNA 序列。
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SHERLOCK 的工作原理. j2 f+ C8 _  q+ n* Z
那么 SHERLOCK 现在能为我们做什么呢？研究人员已经证实，它可以应用于多种疾病，例如传染病病原体的检测、癌症相关的基因突变的检测。
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使用 SHERLOCK 可以分辨出美洲寨卡病毒和非洲寨卡病毒，两种病毒株差异显著* x/ {' Q: U. M% x& c" z: I/ p4 Y
在研究中，他们用含有寨卡病毒和登革热病毒的血样进行了测试，结果显示，即使病毒的滴度（即病毒的毒力）很低，SHERLOCK 还是能捕捉到，而且对于类型很是相似的非洲寨卡病毒和美洲寨卡病毒，SHERLOCK 也能准确的分辨出它们的“身份”。除了血液之外，唾液和尿液也都可以“为 SHERLOCK 所用”。除了病毒的检测外，在大热的癌症液体活检方面，SHERLOCK 也显示了一把它的身手。在人体内，每时每刻都有 DNA 片段进入血液循环中，对于肿瘤患者来说也不例外，所以血液中也能检测到与肿瘤有关的 DNA 片段。但是肿瘤相关 DNA 的比例极低，因而检测的难度也是很大的。在研究人员的设计下，他们用酶将 DNA 转化为 RNA，这样 SHERLOCK 就可以靶定血液中的与肿瘤有关的突变了！
! f. @' |% X2 {, M! L研究人员以两个基因突变为例，进行了验证，他们发现，即使突变的基因只占到基因组 DNA 的 0.1%，SHERLOCK 还是能够将它们检测出来！这无疑会为液体活检领域带来不小的进步。研究的第一作者 Jonathan Gootenberg 说：“SHERLOCK 对两种类型的核酸（DNA 和 RNA）都很有用，它真正的优势在于切割完特定片段之后还具有活性，能够触发‘荧光报告’，让我们知道。”
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8 S/ |6 q1 a) |* d在人类基因组中，SHERLOCK 可以检测出不同的多个单核苷酸多态性（SNP）
$ S+ @  ?  D+ ?$ ~# ]( w" {# {除了这些之外，SHERLOCK 还可以检测人类基因组中的多个单核苷酸多态性（SNP，指基因组水平上单个核苷酸变异引起的 DNA 序列的多态性，是人类可遗传变异中最常见的一种）、抗生素抗性基因、区别包括大肠杆菌和铜绿假单胞菌在内的 5 种特定类型的细菌，而且根据研究人员的介绍，SHERLOCK 甚至还可以区分肺炎球菌和杆菌不同的耐药突变类型！这些对于细菌感染患者的诊断、治疗都有非常重大的意义。对于如此强大的 SHERLOCK，曾经“挑过刺儿”的 Doudna 教授表示，“未来有很多疾病的检测会应用到 SHERLOCK，我们很高兴看到他们的新成果建立在我们曾经提出的‘疾病检测’的主意上，而且我们曾经的‘检验工作’看起来对他们也非常有帮助。”[5]
/ t% u/ h1 N0 b* l* Q$ ]6 E目前，SHERLOCK 在使用的时候可以将所需要的化学物质放在一张玻璃纤维纸上，在各种场景中使用，而且每次的成本只需要 61 美分。研究人员认为，如此方便、快捷的测试对于新传染病爆发时的准确检测有着十分重大的意义，因为传染病最开始出现的地方往往是一些环境较差的不发达国家。
5 m/ ^" R$ B$ j$ R! v* i, [由于 SHERLOCK 广泛的应用范围，所以如何“商业化”也是研究人员很关心的一个问题，Collins 教授说，他们目前正在积极的探索中，很可能会成立一家公司来实现这个目标。当然了，商业化的 SHERLOCK 什么时候能够正式进入市场，这一切都还需要技术的继续完善和 FDA 等机构的监督和认可。
* e! e1 ?" \" s5 }参考文献：
, m" C0 o" g  P. h$ A6 C6 D[1]Jonathan S. Gootenberg et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 2017 DOI:10.1126/science.aam9321
! e- Q$ @0 x$ K4 G2 ^$ C[2] Abudayyeh O O, Gootenberg J S, Konermann S, et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector[J]. Science, 2016, 353(6299): aaf5573.
. I9 P3 q" w3 b; {4 i0 @; \# |[3] East-Seletsky A, O’Connell M R, Knight S C, et al. Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection[J]. Nature, 2016, 538(7624): 270-273.8 C$ U4 H+ X# h+ c% _
[4] Piepenburg O, Williams C H, Armes N A, et al. Recombinase polymerase amplification: U.S. Patent 7,399,590[P]. 2008-7-15.
# l% X  G4 H( j1 |/ x+ U[5] http://www.sciencemag.org/news/2017/04/new-crispr-tool-can-detect-tiny-amounts-viruses, N4 ?9 {6 v- \( O+ w" V