科学时报：干细胞技术及其发展方向

CARRIE

干细胞有如此诱人的临床应用前景，因此干细胞技术的研究开发自然成为当今世界生物医药领域的一个热点研究方向。干细胞技术涉及许多方面，包括干细胞的鉴别、分离纯化、分裂增殖、诱导分化、培养扩增、规模制备、冷冻保存、解冻使用等。还包括干细胞培养液、干细胞生长因子、干细胞分离设备、干细胞再生医学生物材料、干细胞产品保存包装材料等相关技术。本篇着重简述来自不同发育阶段和不同组织的干细胞的相关技术。
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% K$ s- ^( M! r8 Y9 A' l) j% T    胚胎干细胞技术5 A5 ?2 [. \$ j" I4 H" c
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    胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells）具有分化成人体全部类型细胞的能力，所以称为全能干细胞。胚胎干细胞研究可追溯到上世纪80年代初，那时就发现从小鼠受精卵分裂发育而成的囊胚的内层细胞团(inner cell mass)中可以分离出具有分化成多种细胞能力、注入体内可以形成畸胎瘤的胚胎干细胞。随后，各国科学家利用相似技术陆续建立了猪、牛、兔、绵羊、仓鼠和灵长类动物胚胎干细胞系。1998年，美国威斯康星大学的James Thompson和Johns Hopkins大学的John Gearhart在人类胚胎干细胞研究方面取得了突破性进展。他们分别从一周左右的体外受精获得的胚胎中和流产获得的5~9周胚胎中分离出胚胎干细胞，在与滋养细胞层共培养的条件下，这些细胞可以进行长达数月或更长时间的增殖，同时还保持在适当的条件下被诱导分化为分属三种胚层组织来源的各种细胞的能力。这些开拓性研究工作为近十年来的胚胎干细胞研究的发展奠定了基础，现在建立人胚胎干细胞系已经可以做到使用单个囊胚内层细胞、不使用滋养细胞层的水平。. \+ A# _8 G& c7 l$ J0 l) T
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    目前世界上人类胚胎干细胞系已有数百株，各国科学家们正在共同努力，对这些细胞系进行系统性的比较鉴定研究，以期制定规范化的国际性胚胎干细胞标准。胚胎干细胞建系建库的目的主要用于研究人体发育的生理病理机制，当然，科学家也期待在不久的将来能在临床上应用胚胎干细胞治疗疾病。然而，由于胚胎干细胞具有成瘤性和分化难控性等安全性问题，胚胎干细胞应用于疾病的治疗这一良好愿望的实现尚需时日。
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    体细胞核移植技术7 b3 ~1 H# d  ~* L. q" f# ]) f# G
     
8 C3 y1 Z1 w3 O  U    体细胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer, SCNT） 是指取出卵细胞的细胞核，之后把从一个体细胞（例如皮肤细胞）分离出来的细胞核移植入已脱细胞核的卵细胞中，然后这个卵细胞在一定的刺激下发育分裂成囊胚，再从囊胚的内层细胞团中分离获得胚胎干细胞的技术。著名的“多利羊”就是苏格兰科学家利用这种技术获得的世界第一例克隆动物，应用同样的技术还克隆出了鼠、牛、狗、猪、猫等动物，所以这项技术也被称为生殖性克隆（Reproductive Cloning）。理论上，采用体细胞核移植技术可以获得携带任意一个病人全部遗传信息的干细胞用于治疗疾病，因此此项技术又被称为治疗性克隆(Therapeutic Cloning)。与经典的胚胎干细胞相比，体细胞核移植技术的优势是可以获取病人特异性干细胞，用于治疗时应不会引起免疫排斥反应,但体细胞核移植的技术复杂，成功率低，特别是到目前为止，还没有成功利用此项技术获得人胚胎干细胞系的报道。研究“多利羊”的苏格兰科学家也宣称放弃治疗性克隆技术的研究。因此，治疗性克隆技术的成熟和应用前景比较渺茫。
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. N: e  o, ?) u    诱导多能干细胞& e: [* z/ ^) ]9 |
     
9 t  w/ `: i% b    2006年日本京都大学山中伸弥领导的实验室在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem cells，iPS）的研究。他们把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这4种转录因子引入小鼠胚胎或皮肤纤维母细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等都与胚胎干细胞极为相似。随后，他们进一步通过改进筛选技术得到了更接近于胚胎干细胞的多能干细胞，把这些细胞注入小鼠囊胚中再植入体内后可孕育出活的遗传混杂型（Chimera）仔鼠，甚至产出完全由iPS细胞发育而成的仔鼠。很快，美国的几家实验室也陆续发表了相似的研究结果。2007年末，Thompson实验室和山中伸弥实验室几乎同时报道，利用iPS技术同样可以诱导人皮肤纤维母细胞成为几乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞，所不同的是日本实验室依然采用了用逆转录病毒引入以上4种因子组合，而Thompson实验室则采用了以慢病毒载体引入OCT4、SOX2加NANOG和LIN28这种因子组合。这些研究成果在科学界和大众媒体中都引起了很大轰动，也因此被美国《科学》杂志列为2007年十大科技突破中的第2位。: R1 f2 g( f" m, y* |
     
& t6 r4 u2 T6 {4 R9 n( h5 Z    2008年，iPS的研究热潮持续高涨，并取得了多项令人瞩目的进展。哈佛大学George Daley实验室利用诱导细胞重新编程技术把采自10种不同遗传病患者病人的皮肤细胞转变为iPS，这些细胞将会在建立疾病模型、药物筛选等方面发挥重要作用。美国科学家还发现，iPS可在适当诱导条件下定向分化，如变成血细胞，再用于治疗疾病。哈佛大学另一家实验室则发现利用病毒将3种在细胞发育过程中起重要作用的转录因子引入小鼠胰腺外分泌细胞，可以直接使其转变成与?细胞极为相似的细胞，并且可以分泌胰岛素、有效降低血糖。这表明利用诱导重新编程技术可以直接获得某一特定组织细胞，而不必先经过诱导多能干细胞这一步。) n: \5 B' [7 `- K6 q6 f3 ^
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    iPS技术无疑是最近两年干细胞研究所取得的最为突出的成果，因此入选《科学》杂志年度十大科技突破，并名列榜首。与经典的胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术不同，iPS技术不使用胚胎细胞或卵细胞，因此没有伦理学的问题。利用iPS技术可以用病人自己的体细胞制备专用的干细胞，所以不会有免疫排斥的问题。然而，iPS的研究还只是刚刚起步，有许多技术难题还有待解决。例如，现在的iPS技术主要采用病毒载体引入细胞因子，这些病毒随机插进基因组后存在着激活致癌基因或抑制抑癌基因的可能性，许多方法中还使用了c-Myc原癌基因，因此存在较大的致瘤风险，显然不可能应用于临床。当前和今后一段时间的研究将继续优化方法，如使用质粒载体、融合蛋白、小分子等替代病毒载体。另外，目前对iPS特性的认识也很肤浅，究竟它与未经任何遗传修饰的胚胎干细胞有多少异同还需要通过大量深入细致的研究才能搞清楚。可以预见，在今后相当长的一段时间内，胚胎干细胞技术、体细胞核移植技术和iPS技术还不太可能进入临床应用阶段，需要继续研究和共同发展。
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    组织多能干细胞技术8 h# A+ P# m3 i
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    组织干细胞又称体干细胞或成体干细胞，位于人体组织器官之中。现在除了从骨髓和血液中分离组织干细胞、还从人的胎盘、脐带、肌肉、大脑、皮肤、脂肪、滑膜等多种组织中获取各种干细胞。组织干细胞是已经进入临床应用的干细胞。造血干细胞是造血组织的多能干细胞。造血干细胞移植目前已成为治愈恶性血液病最有效的方法，也是治疗某些免疫异常性疾病、遗传性疾病、代谢性疾病，尤其某些实体瘤和放射病的重要途径。造血干细胞技术的一个重要研究进展是造血干细胞在血管疾病中的应用。近年的研究发现，造血干细胞和血管干细胞的界限并不清晰、功能上有重叠，而且能相互转化。两者实质上是一群处于不同分化阶段的干细胞。中国医学科学血液学研究所院韩忠朝教授课题组在国际上首次开展外周血干细胞移植治疗重度下肢缺血包括动脉硬化性闭塞症、糖尿病足等，取得显著疗效，使多患者避免了截肢。目前，利用造血干细胞治疗缺血性血管疾病已经在临床上广泛开展，不但用于治疗下肢缺血，而且开始用于心脑血管病的治疗，进一步的研究正在不断深入。
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    间充质干细胞，一种特殊类型的组织干细胞，具有多向分化和免疫调控功能。间充质干细胞已经在临床上广为使用，使用数量仅次于造血干细胞，但治疗范围大于造血干细胞。目前已产生的技术可以大量扩增、规模化制备间充质干细胞制剂，使细胞产品走出个体化治疗的框架，真正具备药物的通用性、批量生产等属性基本成为可能。( a. K) }- t  W! x" Y
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    干细胞技术的迅猛发展，给人类健康带来了巨大的福音。但干细胞技术普遍用于临床，仍有很长的路要走。充分利用和发挥我国的干细胞资源优势和临床研究优势，坚持自主创新，坚持科学前沿和社会需求两手抓、两手都要硬的原则，才有可能使我国在世界干细胞技术的竞争中能保持优势。  H, s6 U& C- }  M, I
     
- U: b, e/ i2 ~) h6 s6 @$ n$ x& X- y    （朱德林） 2009-1-14