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作者：吴晓牧，丁伟荣，王卫真，易敬林，何丹，陈元仲作者单位：330006 南昌，江西省人民医院临床医学研究所（吴晓牧，丁伟荣，王卫真，易敬林，何丹）;福建医科大学第一附属医院血液科（陈元仲）
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【摘要】 目的 探讨人骨髓间充质干细胞(hMSC)向神经元和多巴胺神经元分化的潜能。方法 分离和纯化hMSCs；在体外以WHIP131预处理和碱性成纤维细胞生长因子预诱导后，全反式维甲酸和胶质细胞源性神经营养因子联合诱导hMSCs向神经元和多巴胺神经元分化。光镜下观察其分化过程中hMSCs的形态变化，免疫组化检测诱导前后细胞是否表达神经元和多巴胺能神经元标志蛋白。结果 诱导后的hMSCs能分化成为具有典型神经元形态的细胞，并明显表达抗人神经巢蛋白（nestin）［（54.2±3.7）％］和神经元特异性烯醇化酶(NSE)［（77.0±5.7）％］，低表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)［（8.8±2.4）％］;对照组细胞这些表达均为阴性；而且相当部分hMSCs表达酪氨酸羟化酶（TH）［（36.5±15.8）％］和多巴胺转运体（DAT）［（26.0±14.2）％］。结论 在适当条件下，hMSCs可分化成为神经元样细胞和多巴胺神经元样细胞。 6 Y. J9 J( i7 G# i8 n
【关键词】骨髓间充质干细胞；分化；神经元样细胞；多巴胺神经元样细胞% t5 q( o$ }# a/ w0 n6 r/ m' ?
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- Q2 h, T6 y) M6 p3 Z- S Study the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into dopaminergic neuronlike cells in vitro7 ]) T# I' o) P" w* u
* ]- ~0 z' ^# |( e! u WU Xiaomu, DING Weirong, WANG Weizhen, et al.; F% q- R0 X2 ]0 J) b
+ i% x) I0 H' i. c$ U* t Institute of Clinical Research, Jiangxi Provincial Peoples Hospital, Nanchang 330006,China
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Abstract：ObjectiveTo explore the differentiation of human bone marrow measenchymal stem cells (hMSCs) into neuronlike and dopaminergic neuronlike cells in vitro.MethodsThe hMSCs were isolated from adult human bone marrow and expanded on the flask undifferentiated state for 2 passages. After pretreatment with WHIP131 for 48 h, the hMSCs were cultured at the medium containing 10 ng/ml basic fibroblast growth factor for 24 h, then incubated with alltransretinoic acid and glialderived neurotrophic factor in serumfree media for 5 h. The surface markers of differentiated neuron were detected by immunocytochemical method and the transdifferentiation processwas observed under light microscope.ResultsUnder induction conditions, hMSCs progressively resumed typical neuronal morphological characteristics. After hMSCs were incubated in induction medium for 5 h, the percentage of NSE, nestin, GFAP, TH and DAT positive cells were (77.0±5.7)%, (54.2±3.7)%,(8.8±2.4)%, (36.5±15.8)% and (26.0±14.2)%, respectively. There were no positive expressions in the control group.ConclusionThe hMSCs are able to differentiate into neuronlike and dopaminergic neuronlike cells in vitro.& f: N0 D. R. \4 g. a6 m
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Key words：mesenchymal stem cells；differentiation；neuronlike cells；dopaminergic neuronlike cells; t" J& V6 B, s
% H9 f- f# T; p9 O, j$ j0 f1 N 帕金森病（PD）主要是由于黑质纹状体多巴胺神经元丧失引起的,细胞移植替代疗法是治疗PD的一种理想方法。一直以来，胚胎干细胞、神经干细胞等被认为是移植治疗神经疾病的首选细胞，但其存在的缺点如组织相容性、伦理学因素，限制了其临床大规模应用［1］。近年来国内外多个实验研究［24］报道了人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在体外条件下可分化为神经元样细胞，且具有取材方便、体内植入反应弱等特点，是一种理想的组织工程种子细胞。目前，有关hMSCs向神经元分化的研究报道较多，而向多巴胺神经元转化的报道很少。为此，本研究联合应用WHIP131与不同生长因子，在一定程度上模拟中脑多巴胺神经元发生、发育的条件，探讨体外hMSCs向神经元和多巴胺神经元分化的潜能，为其治疗PD等神经变性疾病提供理论依据。# x% R- M) m0 W- y" Q/ \1 V; w
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1材料与方法
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1.1材料
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2 ]6 s) _' n' w3 A 1.1.1主要试剂与抗体胎牛血清(FBS，Gibco 公司),全反式维甲酸(ATRA)、WHIP131(Sigma 公司)；重组人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)、重组人胶质细胞源性神经营养因子（hGDNF）(Pepro Tech公司);兔抗人神经元特异性烯醇化酶(NSE) 多克隆抗体、兔抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多克隆抗体、免疫组化试剂盒等(均购自北京中山生物技术有限公司);小鼠抗人神经巢蛋白（nestin）单克隆抗体、小鼠抗人酪氨酸羟化酶（TH）单克隆抗体、大鼠抗人多巴胺转运体（DAT）单克隆抗体等(Chemicon公司);流式抗体除FITC CD105购自Ancell 公司，其余均购自美国BD 公司;流式细胞仪（美国BECMAN COULTER公司）。
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1.1.2骨髓标本来源于8例非造血系统疾病的患者或骨髓移植供者髂骨骨髓，男2例，女6例；年龄16～45岁，平均32岁。患者及家属知情并同意。
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1.2方法5 W* ]4 ^& ?8 N
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1.2.1hMSCs的分离与培养取骨髓血3～5 ml，加等量PBS稀释后，沿管壁缓慢加于淋巴细胞分离液面上，2500 r/min，离心25 min。吸取交界面单个核细胞层置另一离心管中，PBS洗涤3次后，加入含体积分数为10鸖的DMEM/F12培养液，按1106/ml 密度接种，置于37℃、5%CO2饱和湿度下培养。当细胞铺满培养板底80%以上时消化传代，调整细胞浓度为2104个/ml，接种于25 ml培养瓶中，即为第1代hMSCs，再次传代为第2代hMSCs，依次类推。定期置于倒置相差显微镜下观察与照相。
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1.2.2hMSCs细胞表面标志分析将第2代hMSCs用PBS洗涤后，用PBS重新悬浮，制成1106/ml的细胞悬液加入流式细胞检测试管，每管250 μl，在各管中分别加入以下抗体：CD34FITC/ CD166PE、CD29PE/HLADRPc5、CD105FITC/HLADRPc5 10 μl，室温温育30 min，PBS洗去未结合抗体，流式检测缓冲液1 ml重悬细胞，上流式细胞仪检测，以同种荧光标记的IgG1抗体作为阴性对照确定背景标记，同一条件检测其他各管的细胞，每次至少分析5000个细胞，检测阳性率。* Z, }# y- f3 D5 H* P* [1 c% J
8 Q( t0 r J. B/ H8 [ 1.2.3hMSCs定向诱导分化取生长状态良好的4例骨髓hMSCs（第2代）进行诱导分化。当细胞铺满培养皿底约50%时，更换为含10鸖、40 mg/L WHIP131的DMEM/F12培养液预处理48 h，PBS洗涤3次，加入含20鸖、10 ng/ml hbFGF的DMEM/F12培养液预诱导24 h，PBS洗涤3次，加入含1 μmol/L ATRA的无血清DMEM/F12培养液诱导15 min后，添加50 ng/ml hGDNF继续诱导5 h。对照组加入含10% FBS的DMEM/F12培养液培养，不添加任何诱导分化试剂。
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1.2.4免疫组化检测诱导分化后，用冷丙酮固定细胞20 min，PBS洗涤3次，滴加3%H2O2 10 min，蒸馏水洗涤，5%正常血清封闭，15 min后甩去，分别滴加抗人nestin、NSE、 GFAP、TH和DAT抗体等一抗(滴度分别均为1∶200)，置湿盒中4℃过夜，PBS洗涤3次后滴加二抗，37℃反应20 min，PBS洗涤3次后滴加辣根过氧化物酶工作液，37℃反应20 min后，加DAB工作液室温显色至适当程度（10～20 min）。细胞的胞浆中有棕黄色颗粒为阳性细胞。光镜下随机选取的10个非重叠视野，计数300个细胞中阳性细胞占总细胞数的百分数为阳性表达率。
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1.2.5统计学方法实验数据以均数±标准差(±s)表示。
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2结果6 G' F: }" {/ Q$ q- s4 U
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2.1hMSCs的形态观察骨髓单个核细胞接种于塑料培养瓶中24～48 h后出现贴壁细胞。以梭形、小角形及椭圆形多见，分布不均，部分呈巢状生长。随后梭形细胞生长逐渐占优势，约18～21 d左右铺满瓶底。传代后生长速度快，形成均一的长梭形、多角形细胞，其他形态的细胞极少见，一般7～10 d便可达70%～80%融合，18 d左右出现致密的贴壁层。见图1、2。
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5 y, ^% d4 F1 L$ D" A4 ~* [) v 2.2细胞表型表达8例第2代hMSCs的表面标志表达情况：强表达CD29［（93.2±6.0）%］，较强表达CD105［（76.1±6.2）%］和CD166［（60.3±9.2）%］，少量表达CD34［（2.1±0.72）%］、HLADR［（3.4±3.0）%］。
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8 h, R0 K! t5 `5 N 2.3hMSCs诱导分化的形态学变化经10 ng/ml hbFGF预诱导24 h后，hMSCs形态无明显变化。加入ATRA和hGDNF诱导，1 h后,观察到扁平细胞的胞体向内收缩，呈圆形或椭圆形，并向周围长出较长的突起，有立体感，折光性增强，5 h后分化为简单双极或大的多极细胞，极少数表现为锥形，胞体能伸展很长的突触，表现出典型的神经元样细胞形态。对照组细胞形态无明显变化。8 U5 ]3 \+ W( E# D+ S9 q: y5 _
. {$ m5 A5 Z! \+ u% U 2.4hMSCs诱导分化后免疫组化表达见图3～4。诱导后绝大多数hMSCs能分化为具有典型神经元样的细胞，可见NSE、nestin、GFAP、TH和DAT等神经细胞标志表达。实验组细胞免疫组化表达阳性率：nestin为（54.2±3.7）％，NSE（77.0±5.7）％，GFAP （8.8±2.4）％，TH（36.5±15.8）％，DAT（26.0±14.2）％。对照组上述特异性标志物表达均阴性。
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; z* u/ j6 ?! m: g 图1第1代hMSCs培养第18 d时呈长梭形（200）（略）0 ~3 K9 O& s& D: U: P
! L1 ~& c9 v9 Q) w 图2第2代hMSCs诱导分化后呈典型神经元样形态（200）（略）* X3 I* ^' R; k3 o
8 x0 f/ g4 n- I/ E2 Y 图3第2代hMSCs定向诱导分化后部分细胞表达TH (400) （略）$ q9 h/ K/ f* r( \0 R# O
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图4部分细胞表达DAT (400)（略）
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3讨论
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骨髓间充质干细胞（MSC）又称中胚叶未分化间质干细胞，具有多向分化潜能［24 ］ ，在适当的条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。近来研究［35］表明，hMSCs能在体外一定的诱导条件下可分化为神经元样细胞，移植后能在脑组织中存活；但未经诱导分化的MSC体内主要分化为胶质细胞，神经元分化率低。郭丽等［6］尝试联合应用多种细胞因子和诱导剂诱导大鼠MSC向多巴胺神经元样细胞分化，但NSE阳性率仅为（27.774±2.747）%，TH仅为（3.098±0.352）%。如何提高hMSCs向神经元分化的成功率，及促进其向特定种类神经元（如运动神经元、多巴胺神经元等）进一步分化，已成为国内外MSC研究的热点和难点之一。研究表明，hMSCs的分化潜能与其传代次数有关。常颖等［7］报道:hMSCs传代次数增加到一定程度，其向神经元的分化潜能显著下降。由于原代和第1代hMSCs含有相对较多的其他细胞如造血细胞［5，6］，故本实验主要以第2代hMSCs为研究对象。结果显示，第2代hMSCs的CD29、CD105和CD166阳性表达率高，CD34和HLADR低表达，与大多数文献［5-7］报道的一致，表明本研究获得的细胞主要为hMSCs。
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2 |* f. `) t0 w' V- p# H 研究［8，9］表明，在发育早期神经干细胞表达多种转录调控因子，促进神经元产生，抑制胶质细胞分化，其主要作用途径是通过抑制JAKSTAT途径激活。在发育晚期，神经干细胞内JAKSTAT信号转导途径激活，导致神经干细胞转变为胶质细胞产生型［8］。国外文献［9］ 报道，经WHIP131处理后hMSCs的nestin（神经元前体细胞标志物）阳性表达率增加。本研究预实验中，未能证实这一结果，但发现经WHIP131处理后，hMSCs经过诱导可分化为DAT表达阳性的神经元样细胞。DAT是多巴胺神经递质的转运载体，是一种多巴胺神经元的特异性标志。提示，WHIP131抑制JAKSTAT信号转导途径激活，可为其他诱导剂和细胞因子诱导hMSCs分化为多巴胺神经元提供有利的作用时间。进一步实验结果显示：诱导后绝大多数hMSCs能分化为具有典型神经元形态的细胞，NSE阳性率为（77.0±5.7）％，与文献报道相似［4］ ；相当部分细胞表达TH［（36.5±15.8）％］和DAT［（26.0±14.2）％］。上述结果表明，本实验体外诱导分化培养获得了高比例的神经元，包括较多的多巴胺神经元，为临床hMSCs移植治疗中枢神经系统变性疾病和脑血管疾病提供了实验依据。
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目前，hMSCs向神经元样细胞分化的机制尚不清楚，可能是多因素共同作用导致hMSCs细胞核的基因表达程序改变，激活了神经外胚层遗传基因表达程序的启动，促进hMSCs分化成神经元样细胞，甚至出现较多的多巴胺神经元样细胞。另外，hGDNF对于多巴胺神经元生成和存活极为重要，可促进多巴胺神经元胞体增大、神经突生长、提高TH表达及多巴胺水平［10-12］。但其具体机制有待进一步研究。
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