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Lewis大鼠骨髓间充质干细胞分离培养和鉴定

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发表于 2009-3-3 11:46 |显示全部帖子
作者:郑辉哲 1 ,林 群 2 ,雷立华 3 ,杨 进 4 ,韩 涛 3 2 m: j0 r' W" Z. |
                  
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3 w+ W6 o8 M1 {+ N  D" U; d          【关键词】大鼠,近交Lew;细胞分离;细胞培养;干细胞;骨髓细胞;细胞周期;细胞分化
6 d+ G5 J+ K' _0 C                    摘要: 目的建立从Lewis大鼠骨髓中分离、培养间充质干细胞的方法,并对分离、培养的间充质干细胞进行鉴定。方法采用Percoll(1.073g/L)密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法分离培养Lewis大鼠的骨髓间充质干细胞(MSC)。MSC细胞鉴定:采用相差显微镜观察MSC的形态学特征;流式细胞仪检测细胞表面标志抗原CD 29 ,CD 90 ,CD 34 和CD 45 的表达率;苏丹Ⅳ染色检测MSC成脂细胞分化;碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测MSC成骨分化。结果原代培养的MSC于24h后贴壁,48~72h形成集落,12~15d可达到80%~90%融合。第1代细胞表面标记物CD 29 ,CD 90 ,CD 34 和CD 45 的阳性率分别为80.41%,66.27%,2.73%,0.74%。第3代细胞表面标记物CD 29 ,CD 90 ,CD 34 和CD 45 的阳性率分别为89.91%,88.17%,0.81%,0.17%。细胞周期分析显示,第5代细胞G 0 /G 1 期细胞占68.9%,S G 2  M期为31.1%。用α-MEM培养液培养的第6代细胞部分分化为成骨和成脂细胞。结论采用Percoll(1.073g/L)密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法能够成功分离和培养大鼠的MSC。第5代MSC细胞保持分化潜能。  关键词:大鼠,近交Lew;细胞分离;细胞培养;干细胞;骨髓细胞;细胞周期;细胞分化  骨髓间充质干细胞(MSC)移植治疗心肌梗死的研究常选用近交系Lewis大鼠为实验对象,以减少异体移植排斥反应和建立稳定的心肌梗死模型。笔者拟从近交系Lewis大鼠的骨髓分离、培养、扩增MSC,流式细胞仪检测表面标记物,并促进其向成骨及成脂细胞分化来获得进一步证实,了解MSC的增殖特性,为后续的MSC移植治疗心肌梗死的研究奠定基础。 $ N. C/ F8 |; u7 c7 w9 Y
  1 材料与方法  1.1 动物 SPF级雄性Lewis大鼠(4周鼠龄,120g左右)。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(北京市实验动物质量合格证:0031492)。  1.2 主要试剂和药品 α-MEM培养基(Gibco公司),DMEM-LG培养基(Gibco公司),Percoll分离液(Pharmacia公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),青、链霉素(Serva公司),胰酶(Amresco公司),乙二胺四乙酸(EDTA,Gibco公司),茜素红(Sigma公司),苏丹Ⅳ醇(Sigma公司),DNA分析试剂盒(Coulter公司),仓鼠抗大鼠-CD 29 -FITC(PharMingen公司),小鼠抗大鼠-CD 45 -FITC(Caltage公司),小鼠抗大鼠-CD 90 -FITC(Caltage公司),小鼠抗大鼠-CD 34 -PE(Santa Cruz公司)。  1.3 原代大鼠MSC分离培养 采用离心分离和贴壁培养法 [1-2] 。处死大鼠,无菌条件下获取双侧股骨和胫骨。用DMEM-LG培养液(每10mL含肝素50mg)冲出骨髓,充分吹打混匀后制成4×10 7 mL -1 悬液。将细胞悬液缓慢地叠加到预先装有等量Percoll分离液(1.073g/L)的离心管上层,1100r/min离心30min,收取位于分离介质之间的单个核细胞。PBS洗涤两遍,加入DMEM-LG全培养液(含10%胎牛血清,100U/mL青霉素,100U/mL链霉素),以1.5×10 5 cm -2 的密度接种于培养瓶中,在37℃、体积分数为0.05的饱和湿度培养箱内培养,24和72h后各换液一次,去除非贴壁细胞,以后每3~4d换液1次。细胞生长达到80%~90%融合时,用0.05%胰酶 0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化,1∶3传代扩增培养。  1.4 细胞表面标记物检测 0.25%胰酶 0.02鞹A消化收获第1代和第3代细胞,与饱和浓度的抗CD 29 -FITC、CD 45 -FITC、CD 34 -PE、CD 90 -FITC单克隆抗体及其同型对照混匀,室温下闭光反应20min,PBS洗涤细胞,行流式细胞仪检测,EXPO32.V1.2软件分析。  1.5 促进MSC向成骨和成脂细胞分化 取第6代细胞,换为含10%胎牛血清的α-MEM培养液,每6~7d换液,让细胞处于半饥饿状态,用倒置相差显微镜观察细胞形态变化,20d后分别行茜素红染色显示是否钙盐沉积,AKP染色显示是否产生AKP和苏丹Ⅳ醇染色有否出现脂肪;用正常培养的第4代细胞做对照。
6 l+ x" V6 R" Y# X0 ~  1.6 细胞增殖周期分析 取生长良好的第5代细胞,消化后制作悬液,4℃预冷的70%乙醇固定30min;预冷PBS漂洗离心,37℃50μg/mL的RNAseA处理30min,加入50μg/mL碘化丙啶(PI)0.5mL,4℃闭光染色30min,流式细胞仪检测,Multicycle软件分析。  1.7 染色方法 (1)茜素红染色。倒置显微镜下观察含胎牛血清的10%α-MEM培养液培养的第6代MSC钙化结节生长情况,当出现肉眼可见结节后,用茜素红法染色。PBS洗两次,95%乙醇固定10min,蒸馏水冲3次,加入0.1%茜素红-Tris-HCl(pH8.3),37℃30min,蒸馏水冲洗后观察。用正常培养的第4代细胞做对照。(2)碱性磷酸酶(AKP)检测(钙钴法显示)。取出长细胞的盖玻片,PBS漂洗,95%乙醇固定10min,37℃孵育1~3h(孵育液成分为:2%β-甘油磷酸钠25mL,2%巴比妥钠25mL,蒸馏水50mL,2%氯化钙5mL,2%硫酸镁2mL)。取出盖玻片,蒸馏水冲洗。2%硝酸钴作用2min,水洗1min,去除多余硝酸钴。1%黄色硫化铵作用1min,水洗2min,0.1%沙黄复染1min,镜下观察。用正常培养的第4代细胞做对照。(3)苏丹Ⅳ醇染色。取第6代诱导后的MSC,PBS液清洗细胞一次,4%多聚甲醛固定10min,蒸馏水冲洗3次,饱和苏丹Ⅳ醇溶液染色2h,蒸馏水冲洗3次,倒置相差显微镜观察及拍照。用正常培养的第4代细胞做对照。  2 结 果  2.1 原代培养过程 在接种24h后见部分贴壁的圆形细胞,48~72h后呈纺锤形、梭形、多角形,每个细胞形成一个集落,增殖迅速,集落之间相互靠进;原代培养约12~15d可达到80%~90%融合(图1)。无接触抑制现象,融合后呈旋涡状。以1:3传代的细胞24h内完全贴壁,4~6d内达到80%~90%融合。原代培养发现局部区域有少许小而圆的细胞,传代后消失。第2代以后,细胞形态比较均一。传至8~10代,细胞逐渐老化,碎片增多,形态趋向扁平,增殖速度明显减慢直至停止。  图1原代培养14d的骨髓间充质干细胞,100%融合(略)  2.2 表面标记物检测 生长良好的贴壁细胞在第1代和第3代行表面标记物检测。第1代细胞纯度80%左右,第3代细胞纯度90%左右(图2)。  图2第3代骨髓间充质干细胞表面标记检测结果 略  2.3 MSC向成骨和成脂细胞分化  2.3.1 钙化结节检测结果 用α-MEM培养液培养的第6代细胞,在连续培养15d可见细胞复层生长,局部增厚,细胞集落中心出现不透光的沉积物,随培养时间增加而变大,并出现肉眼可见的结节(图3A),茜素红染色见沉积物被染料染成深红色斑块,为钙盐特征性染色(图3B)。正常培养的第4代MSC细胞也有细胞重叠生长现象,但茜素红染色阴性。  2.3.2 AKP染色 用α-MEM培养液培养15d的第6代细胞AKP染色为阳性,AKP染成黑色,0.1%沙黄将BMSC细胞质染成淡红色(图4)。正常培养第4代细胞AKP染色为阴性,BMSC仅细胞质被染成淡红色。  2.3.3 苏丹Ⅳ醇染色 用α-MEM培养液培养15d的第6代细胞,在倒置相差显微镜可见细胞质有脂滴沉着(图5A),苏丹Ⅳ醇染色为红色(图5B)。对照BMSC苏丹Ⅳ醇染色阴性。  图4α-MEM培养液培养15d的第6代骨髓间充质干细胞,AKP染色阳性(略)   图5α-MEM培养液培养的第6代骨髓间充质干细胞(略)  2.4 细胞增殖周期(图6) 第5代细胞G 0 /G 1 期细胞占68.9%,S G 2  M期为31.1%。二倍体细胞占总数84.3%,其中G 0 /G 1 期细胞为77.4%,S G 2  M期为22.6%。异倍体细胞占总数15.7%,其中G 0 /G 1 期细胞为23%,S G 2  M期为77%,DNA指数(DI)=1.777。  3 讨 论  由于骨髓的细胞组成复杂,细胞功能各异,其中  图6第5代骨髓间充质干细胞增殖周期曲线 略  MSC含量很低,约为骨髓低密度组分中有核细胞的0.001%~0.01%,故分离高纯度的MSC是原代培养关键性技术 [3-4] 。笔者采用Percoll密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法,即利用Percoll将大部分造血细胞和单个核细胞分离,经过体外贴壁培养换液去除悬浮生长的造血干细胞,分离获得MSC的纯度达到90%左右,与Pittenge等报道相近 [3] 。  间充质干细胞没有特异性表面抗原,但研究发现间充质干细胞有如下特点:不表达CD 34 、CD 45 ,而只表达CD 29 、CD 44 、CD 71 、CD 90 等基质细胞和间质细胞的特异性表面标志抗原 [5] 。本研究选择了CD 29 、CD 90 、CD 34 和CD 45 进行检测。结果表明,培养的细胞CD 29 和CD 90 阳性,CD 34 和CD 45 阴性,符合MSC的特点。同时表明,第3代MSC的CD 29 、CD 90 的阳性率和CD 34 、CD 45 的阴性率比第1代高,提示MSC的连续培养是其不断纯化的过程。  由于间充质干细胞没有特异性表面抗体,故其鉴定仍是一个难题。目前,MSC鉴定方法都是通过在培养过程中出现分化表型,然后逆推得知是否为MSC。间充质干细胞具有多向分化潜能,能分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞 [3] 。间充质干细胞还可能具有可塑性,即成体干细胞能产生与它存在部位组织不同的其他组织类型特异细胞,有些研究认为,间充质干细胞能诱导分化为心肌细胞、神经细胞等 [6-7] 。但是,关于成体干细胞是否具有可塑性还存在很大争议,有一种观点认为可塑性是细胞融合的表象 [8-10] 。所以,笔者选择在体外促进所培养的细胞向成骨细胞和成脂细胞分化的方法来逆推。研究结果表明,以含10%胎牛血清的α-MEM培养液半饥饿法培养使部分细胞分化为成骨细胞(具有钙化结节和AKP染色阳性)及成脂细胞(显微镜下见到脂滴及其苏丹Ⅳ醇染色阳性),间接证实了分离培养的细胞是间充质干细胞。  值得注意的是,经过大量传代以后,有些细胞仍能保持其分化潜能,而有些细胞则向特定方向分化或开始衰老,验证MSC经过大量扩增后是否仍保持分化潜能是十分重要的。笔者发现,用加胎牛血清的α-MEM培养液培养的大鼠MSC在传至第6代后,部分细胞逐渐自发分化为成骨细胞及成脂细胞;而对照组细胞(用DMEM-LG培养液培养的第4代细胞)未见分化细胞。同时对第5代MSC行细胞周期检测,G 0 /G 1 期细胞占68.9%,S G 2  M期为31.9%,两者都提示用DMEM-LG培养液培养的第5代以前的MSC仍保持较高的分化潜能。 * |) S  t3 H) q. G. W( ~' I  X, J! [
  参考文献:  [1] 王永红,王常勇,郭希明,等.人骨髓间质干细胞体外扩增和向成骨细胞分化的实验研究[J]. 中国生物医学工程学报, 2002,(3):251-255.  [2] 张 坡,黄 岚,蒋世忠,等.小鼠骨髓间质干细胞的生物学特点及分化潜能鉴定[J]. 中华心血管病杂志, 2003,9:681-684.  [3] Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage poten-tial of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(5411):143-147.  [4] 王 伟,张志坚,林建华,等.大鼠骨髓间质干细胞培养扩增及表面标志[J]. 福建医科大学学报, 2005,39(1):5-8.  [5] 凌诒萍. 细胞生物学 [M].北京:人民卫生出版社,2001:255.[6] Makino S,Fukuda K,Miyoshi S,et al.Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro[J].J Clin Invest,1999,103(5):697-705.  [7] Woodbury SD,Schwarz EJ,Prockop DJ,et al.Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J].JNeurosci Res,2000,61(4):364-370.  [8] Medvinsky A,Smith A.Stem cells:Fusion brings down barriers[J].Nature,2003,422(6934):823-825.  [9] Wang X,Willenbring H,Akkari Y,et al.Cell fusion is the prin-cipal source of bone-marrow-derived hepatocytes[J].Nature,2003,422(6934):897-901.  [10] Alvarez-Dolado M,Pardal R,Garcia-Verdugo JM,et al.Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons,cardiomyocytes and hepatocytes [J].Nature,2003,425(6961):968-973.  Isolation,Cultivation and Identification of Mesenchymal Stem Cells from Lewis Rat Bone Marrow  ZHENG Hui-zhe 1 ,LIN Qun 2 ,LEI Li-hua 3 ,YANG Jin 4 ,HAN Tao 3  1.Department of Anesthesiology,Fujian Provincial Tumor Hospital,Fuzhou 350014,China$ p+ D2 v. s# w
2.Department of Anesthesiology,The Affiliated First Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China
* C+ T; t* ?0 x  3.Department of Surgery,Fujian Provincial Research Lnstitate for Cardiovascular Diseases,Fuzhou 350001,China4.Center of Implantion,The Affiliated Stomatological Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350002,China  ABSTRACT: Objective To establish a method for isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells(MSC)from Lewis rat in vitro and to identify characteristic of the cells after culture expansion. Methods MSC were isolated and cultivated from the bone marrow of Lewis rats by Percoll gradient centrifuga-tion and investigated their adherence-dependent growth characters. The morphology of MSC was observed un-der phase contrast microscope. The expression of CD 90 ,CD 45 ,CD 34 and CD 29 of the cells were analyzed by flow cytometry. Adipogenic differentiation was studied by SudanⅣstaining,osteogenic differentiation by al-kaline phosphatase(AP)staining,bone nodule formation by Alizarin red S staining,and cell cycle by flow cy-tometry. Results After24hours primary culture,MSC adhered to plastic surface of the culture dish. After48~72hours culture,the cells proliferated in colonies. These primary MSC reached80%~90%of confluence in12~15days. The positive rates of CD 29 ,CD 90 ,CD 34 ,and CD 45 in MSC at P 1 (first generation)were80.41%,66.27%,2.73%,and0.74%respectively,and at P 3 89.91%,88.17%,0.84%,and0.17%re-spectively. Cell cycle studies revealed that while a small fraction of MSC at P 5 (fifth generation)are actively engaged in proliferation(approximately31.1%at S G 2  M),the vast majority of cells are standing at the G 0 /G 1 phase of the cell cycle(approximately68.9%at G 0 /G 1 ). Part of culture-expanded MSC at P 6 (sixth generation)cultivated inα-minimum essential medium(α-MEM)showed positive by alkaline phosphatase stain-ing,Alizarin red staining,and SudanⅣstaining. Conclusion Mesenchymal stem cells can be successfully isolate and cultivate from rat bone marrow by Percoll gradient centrifugation and keeps its adherence-dependent growth characters. They retain multipotentiality after culture expansion at P 5 .  KEY WORDS: rats,lnbred lew;cell separation;cell,culture;stem cells;bone marrow cells;cell cycle;cell differentiation
8 g! R( G6 V2 c$ X  作者单位: 1.福建省肿瘤医院麻醉科,福州 350014       2.福建医科大学附属第一医院麻醉科,福州 350005
/ H! ~/ J* [" O# S6 t' [; G       3.福建省立医院心血管研究所心外科,福州 3500014.福建医科大学附属口腔医院种植中心,福州 350002 0 {/ v; a8 k5 T& d8 E" f
  作者简介: 郑辉哲(1971~),男,主治医师,医学硕士.
6 R" I- b, B  ~* B2 p1 b  (编辑:常志卫)

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发表于 2015-5-30 13:35 |显示全部帖子
初来乍到,请多多关照。。。  

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发表于 2015-7-10 15:34 |显示全部帖子
照你这么说真的有道理哦 呵呵 不进沙子馁~~~  

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发表于 2015-7-31 18:01 |显示全部帖子
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要不我崇拜你?行吗?  

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貌似我真的很笨????哎  

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