间充质干细胞向心肌细胞分化的研究进展

文献管理员

作者：曹京燕，程月新综述，姜敏辉审校作者单位：南通大学第四附属医院心内科， 盐城 224006
; C$ _% @+ g2 R, ?$ R& i  f                  
! ?* |/ W8 G& c2 B/ }                  
0 V" C2 c0 C: F( w! M- a          0 K9 T$ X5 u" J
                         1 C" l+ p) N' j" q9 q1 _
            
  a. t4 m' l+ t2 F# w: E+ p( \0 e  m2 g                    ! q% M0 @, }# T  W
            
) Z2 @# I' _) A2 A- Y) z7 f                      3 w8 c) c; R. x  r; X+ H
        # j. M1 B" _7 Q
        ) ]+ e( H1 D' N8 K7 `
        
: m  j& q8 y$ i5 m& `* U0 U& \* w0 F         
$ ^6 x" O5 _7 \) K          【关键词】间充质干细胞；心肌细胞；干细胞移植# B9 U- W2 b. b- r
                  * W2 h4 i; ]& r1 P

$ q# S4 h! i/ S来自于骨髓 的间充质干细胞(mesenchymal stem cells ,MSCs)主要具有：（1）干细胞的自我更新能力。研究细胞周期发现约10%处于S期、G2期和M期，其余90%均处于G0期和G1期,说明了MSCs的高度自我更新能力；（2）分化成不同细胞类型的能力。MSCs可分化为脂肪、骨、软骨细胞等基质细胞，还可分化为内皮细胞、神经细胞、肌细胞等。这种跨系统甚至跨胚层的分化特性，即为MSCs的可塑性[1]。MSCs数量相对稳定,在生命过程中长期存在；MSCs在体外培养时具有易于黏附的特点而易于分离；MSCs取材容易,简单的骨髓穿刺即可获得；MSCs能够进行自体移植,不存在免排斥反应；没有伦理学争议；易于被外源基因转染并稳定表达，可作为基因治疗的载体。所以,在疾病治上,MSCs是一种更为理想的干细胞。本文综述了近年有关MSCs表型特征及鉴定,分离培养的方法,向心肌细胞分化的可塑性和影响因素、以及存在的问题和展望,为MSCs进入临床应用提供实验基础。
+ c9 D) c+ ]- ~" _2 M. R% @7 j+ c+ @9 u; C
1MSCs的形态和特征
  k& I; w( k1 P0 d
* e, t% A+ |/ }骨髓细胞原代接种后最初72 h内培养物中以造血细胞成分居多，随培养时间的延长，这些细胞逐渐坏死或随换液而移去。接种后24 h有少量细胞贴壁，48 h后贴壁细胞明显增多，并开始分裂增殖，72 h后部分区域形成集落。细胞呈多角形、纺锤形、短梭形，胞核质分界清楚,胞体有不规则突起。12～14天后集落迅速增多，逐渐长大融合成片，细胞形态为长梭形及多边形，无接触抑制现象发生，这种贴壁生长的细胞多为MSCs。/ c& z2 W" O: Q) y
% b+ c) C" Q" I: l5 G
MSCs缺乏特异的抗原标志,按其抗原特性分为5类:（1）相对特异性的表面抗原，如SH2、SH3、SH4和STRO-1，这些抗原在MSCs中表达阳性，但并不是MSCs唯一表达的抗原；（2）细胞因子生长因子及其受体。如干细胞因子及其干细胞因子受体等；（3）黏附因子类，如整合素，细胞间黏附分子2等；（4）细胞外基质,如I、III、IV、V和VI型胶原，纤粘蛋白、层粘蛋白等；（5）阴性标志, 主要用于与造血细胞和内皮细胞相区分的标志如CD34、CD43、CD31、CD14等。一般多采用阳性和阴性标志物联合鉴定的方式进行筛选。多数实验室采用在培养过程中贴壁生长, 呈成纤维样，可聚集成均匀集落CD14，CD34，CD45阴性和培养过程中出现的分化表型来逆推是否为MSCs。
) A: q' t  R6 ?/ a! B& }/ v( o# _" F0 ~3 M, D) V4 A' ]1 h8 L
2MSCs的分离与培养
* ~! q9 t0 ?6 N9 a( [) `' A! D5 T) @8 K9 g2 h: q
目前MSCs的分离方法主要有：（1）密度梯度离心法：根据MSCs与其它细胞的密度不同而采用密度为1.073 g/ml 的Percoll分离液或密度为1.077 g/ml的Ficoll分离液将其分离出来；（2）贴壁筛选法:根据MSCs具有在培养瓶中贴壁生长的特性，将该细胞与其它类型的细胞进行分离；（3）流式细胞仪分选法:根据MSCs 细胞体积小,相对缺少颗粒的特性进行分选；（4）免疫磁珠分离法：价格较昂贵,且有报道可能会损伤细胞。密度梯度离心、贴壁培养和消化控制相结合的方法，具有操作简便，快速，实用的特点,被认为是比较理想的分离纯化MSCs的方法[2]。体外培养骨髓MSCs时,血清的浓度、培养的温度、种植细胞的密度、培养基的pH值等都会影响生长增殖的情况。培养MSCs时所用的培养基不尽相同,常用的是DMEM培养基,含10%～20%的胎牛血清（常用20 %）。不同的实验室所采用的细胞密度也不相同,大多数实验室认为高密度传代培养细胞生长缓慢。Bruder等采用5000/cm2较低密度传代培养骨髓MSCs时,发现两周左右细胞集落融合,细胞数扩增3～5倍。Colter 等[3]研究发现0.5～12/cm2极低密度传代培养更有利于细胞增殖，按1.5/cm2密度传代培养可持续50代,而按5000/cm2密度传代培养仅传代15代。还有研究发现[4]，抑制增殖能力有利于MSCs向心肌细胞方向分化。  y  B7 O3 [9 x1 i% b
3 d) e) z% U& M3 z2 s' C+ a6 {
3MSCs的心肌定向诱导分化: _- ?( f! r2 y2 T/ O
, `- Q+ o" V! d7 [' S
研究发现，MSCs在体外经药物诱导,模拟体内微环境或在体内心肌微环境下，能定向分化为心肌样细胞，同时这些细胞显示了心肌的许多功能性特性，见表1。8 p# x7 {1 }8 U# H" B3 c
' a3 ]& v5 ?# ^) I3 b
MSCs也可以分化为血管平滑肌细胞/毛细血管外膜细胞祖细胞和内皮细胞，这些细胞参与血管的生成和扩增[22]。综上所述，MSCs能分化成为心肌和血管并旁分泌生长因子，从而为心梗患者提供来源广泛的理想的心血管细胞。
( d6 H1 O% R! O# L! ^) A" ~
% ~8 s: ~; _/ H9 ]7 `4MSCs向心肌细胞方向分化的影响因素' q$ ]2 ^" U- |. o
# h; X* {/ y1 J3 r' ^/ k
研究显示,MSCs的可塑性存在很大差异，可能与以下因素有关:(1)不同物种的MSCs可能具有不同的分化潜能；(2)不同的培养条件。不同的研究结果可能与不同培养时间对其自身更新以及细胞的分化能力的影响有关。最新研究明MSCs在体外培养一定代数后，它的表型和核型将发生改变,转变为成瘤性细胞，失去原有的可塑性和分化能力[23]。同时MSCs在体外诱导分化的能力与它的增殖能力存在一定的关系，抑制增殖能力有利于它向心肌细胞方向分化[24]；(3)不同分离方法的影响。一般认为MSCs是混合性细胞，其中包括了具有不同可塑性的细胞，因此采用不同的抗原标志物筛选出的MSCs，可能在可塑性上存在很大的差异。
, ^7 A7 B1 o8 w9 t; m* r
1 G9 A/ `1 ?- d- u0 L5 c5尚待解决的问题与未来展望8 _; O' l9 R: l2 }, l' [

+ y/ N5 y+ W( X7 C+ {. j2 q  H干细胞移植技术经历了从基础研究到临床应用的转变过程，但还存在诸多的问题：（1）尚未发现MSCs特异的表面抗原，只有完全从其生物学特性上进行限定，才能更好地研究其可塑性及分化机制和分化调控；（2）何种信号和机制诱导MSCs向心肌分化,目前仍不十分明确；（3）新近的实验表明[22]，MSCs在体外培养过程中有成瘤性转变的趋势等等，这些都是采用MSCs进行细胞移植治疗必须认真对待的因素。因此，MSCs治疗心脏病的临床应用尚需要进行更大规模、更深入的动物实验研究以获得基本数据，并在此基础上开展随机对照的临床试验以客观地评估其有效性和安全性。' [4 `, S8 @1 O! J1 b

& ?& l  |; Z9 Y# V8 a; }- _/ X7 i- f* c
          【参考文献】0 k5 ]# N' }; D0 L4 n- u+ e
[1]   Tsai RY, Kittappa R, Mckay RD. Plasticity, niches, and  the use of stem cells[J]. Dev Cell, 2002,2(6)：707-712.3 o. i' N! L+ b& z2 @) Z' B3 u

) p9 j1 X/ R. I0 C1 |8 I
7 O& M4 {. L3 F( h: W
3 j) f/ l  t, a" N$ g' @- q/ v    [2]   王   勇， 王志伟，陆玉华，等. 成人骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性[J]. 南通大学学报（医学版），2005，25（3）：157-160.6 D# q% u) G1 L  G
9 r4 e. q* I4 s. K: W" U
0 B' ?6 t* C, k) {
7 u7 s- w1 `  e2 {- U
    [3]   Colter DC ,Class R ,Digirolamo CM ,et al. Rapid expansion ofrecycling stem cells in culture of plastic - adherent cells formhuman bone marrow[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2000, 97(7):3213-3218.! C9 c5 Y+ D8 y

/ @0 R6 g6 D7 L% ^4 ~
7 i. x0 v1 R3 o' G- |( Q5 _. Q' Z2 h3 |* D
    [4]   Zhang FB, Li L, Fang B, et al. Passage-restricted different-tiation potential of mesenchymal stem cells into cardiomyocyte like cells[J]. 　Biochem Biophys Res Commun, 2005,336(3)：784-792.$ T5 c' y4 x: u6 K" I# y0 j

/ T+ s2 e" }0 T! j9 p' A4 ~$ E' |: F3 I! E" G; G

1 ]; _# x4 K" m8 q    [5]   Wakitani S, Saito T, Caplan A. Myogeneic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine[J]. Muscle Nerve, 1995,18(12):1417-1426. 2 ~2 Y% Z7 `0 M2 j
& a4 n1 f3 [% R! R" C0 H

5 P7 f/ d' ~# q- g. q0 a4 o: q9 C0 g3 ~) |) R8 M+ Q8 X
    [6]   Makino S, Fukuda K, Miyoshi S, et al.Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro[J]. J Clin Invest,1999,103(5):697-705.
6 Z+ Q, B. r8 b: m* G$ X. S. t. ^# @. [1 R

3 |8 K. I! V; F5 r/ g
1 L( j4 ?$ ?; p1 N3 q7 ^    [7]   Bittira B, Kuang JQ, Al-Khaldi A,et al. In vitro preprogramming of marrow stromal cells for myocardial regeneration[J]. Ann Thorac Surg,2002,74(4):1154-1159.9 x, U, X8 r1 b4 g( |

1 x' O( X2 y/ R! L2 P3 I  G5 _. z* Y9 ~6 q# Y, O4 y" z2 Y

  ]3 M, R$ q  L    [8]   Min JY, Sullivan MF, Yang Y, et al.Significant improvement of heart function by cotransplantation of human mesenchymal stem cells and fetal cardiomyocytes in postinfarcted pigs[J]. Ann Thorac Surg,2002,74(5):1568-1575.   C, j; \4 g3 M" Q1 e9 O* |
" M7 c. j7 }$ c" Z9 c- ]7 H

/ n' R9 F3 @7 e1 A9 {1 `5 y5 e: ~! T5 Q9 c  w5 D
    [9]   Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, et al.Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart[J]. Circulation,2002,105(1):93-98.
" }" R, x  ]8 m2 Z; W* ~" K
9 K3 P- y0 S. v$ L/ W* T0 H! p/ V7 x2 Q2 X
' X# [8 c" D3 `8 m& G- P/ t" O- Z, R
    [10]   Cheng F, Zou P, Yang H,et al. Induced differentiation of human cord blood mesenchymal stem/progenitor cells into cardiomyocyte-like cells in vitro[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2003,23(2):154-157.
$ |% Z3 C( G% G+ `3 B/ o9 C- f( e5 b$ I2 A' M: Z7 H: T
- Z2 w. }/ c) Y5 l2 {5 d- f$ Y

, V# W4 T; N1 s( n" U; N    [11]   Erices AA, Allers CI, Conget PA,et al. Minguell JJ. Human cord blood-derived mesenchymal stem cells home and survive in the marrow of immunodeficient mice after systemic infusion[J]. Cell Transplant,2003,12(6):555-561.
6 `0 m; k. ^: w$ P1 r: k, l" x/ B
$ K2 s+ @) z" D2 C- u4 s

4 p* C5 k: q+ o; _2 u( T' k) z  C    [12]   Fukuda K. Application of mesenchymal stem cells for the regeneration of cardiomyocyte and its use for cell transplantation therapy[J]. Hum Cell , 2003,16(3):83-94.
# e. k5 z- T  F+ X! Q2 {' s- S1 r+ N6 M! g7 P
8 G! t3 ^7 C! G, x

* s& W" [) q; ?0 U# p) [( ~    [13]   Fukuhara S, Tomita S, Yamashiro S,et al. Direct cell-cell interaction of cardiomyocytes is key for bone marrow stromal cells to go into cardiac lineage in vitro[J]. J Thorac Cardiovasc Surg , 2003,125(6):1470-1480.* O" B0 j3 j& {- I: m7 k: S
# s3 z+ |# \( D6 X

6 m4 d& ?- b8 n. ~  j5 \' ?8 S  E, D4 u& y
    [14]   Mangi AA, Noiseux N, Kong D, et al.Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts[J]. Nat Med, 2003,9(9):1195-1201.
) [: o! J: T3 O+ W- _
" |- b- p! k, I/ T- t: f# ?; b: E
: d- ^4 g7 I& D- L' K" j
, _% ^& d- Z2 f! v9 i6 L; [& o    [15]   Rangappa S, Entwistle JW, Wechsler AS,et al. Cardiomyocytemediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2003,126(1):124-132. 2 }7 P% s' z; ]+ v

4 h+ Q7 Y4 p; Y* x; ^( ?' G
7 E/ }1 ~8 s( O, `2 \7 s# e* ~$ t, K- m
    [16]   Liu J, Hu Q, Wang Z,et al. Autologous stem cell transplantation for myocardial repair[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2004,287(2):H501-H511.+ ?% _: z+ `/ ~( V4 s

9 u5 ]2 V& }) ^2 Y) \' e3 m; @
4 ]/ X- P0 \% {+ ^2 m/ A) V4 e* g2 a8 Q- _
    [17]   Nagaya N, Fujii T, Iwase T,et al. Intravenous administration of mesenchymal stem cells improves cardiac function in rats with acute myocardial infarction through angiogenesis and myogenesis[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol , 2004,287(6):2670-2676.4 T" j5 i$ A1 f) `% ~' y

6 R6 I8 A' T+ O. \, X& i4 H9 ^6 ~( Z

3 {) @; x/ H5 `5 W    [18]   Potapova I, Plotnikov A, Lu Z, et al.Human mesenchymal stem cells as a gene delivery system to create cardiac pacemakers[J]. Circ Res , 2004,94(7):952-959.
3 r" r  T3 J3 ]- D0 C+ m& v! P$ |1 v
: H, ~6 c+ y* q; V8 i( o7 s: m7 r8 M; Z8 W$ W2 o$ Z
; b# N$ ^- Z! T, d9 F2 N6 Q! G8 v# R5 z
    [19]   Shim WS, Jiang S, Wong P, et al.Exvivo differentiation of human adult bone marrow stem cells into cardiomyocyte-like cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 324(2):481-488.
( t( X) Y3 V4 \# B) E5 u/ `# T8 i6 n3 A7 h: `& k
8 x' d5 _1 c3 s. T: x- q
/ M* b0 J! ~/ I& a" s" s. |
    [20]   Vanelli P, Beltrami S, Cesana E,et al. Cardiac precursors in human bone marrow and cord blood: in vitro cell cardiogenesis[J]. Ital Heart J , 2004,5(5):384-388.) E7 z' M* }, v- z
  u2 p, ?( e# K/ E3 m: }! v1 W

/ r* x4 |+ W. k% G& ?  B0 v/ D. H* W) [+ L2 ~1 u) R& `3 ~- q* F
    [21]   Xu W, Zhang X, Qian H,et al. Mesenchymal stem cells from adult human bone marrow differentiate into a cardiomyocyte phenotype in vitro[J]. Exp Biol Med(Maywood),2004,229(7):623-631.+ U$ a- |; n3 L/ p0 P" d% _

0 g4 M- F9 X/ V; {
  {' n/ [2 N% J& V$ w" \' a+ c; P) T: z  l5 H
    [22]   Davani S,Marandin A,Mersin N,et al.Mesenchymal progenitor cells differentiate into an endothelial phenotype,enhance vascular density,and improve heart function in a rat cellular cardiomyoplasty model[J]. Circulation,2003, 108(3):253-256.+ u8 P9 r$ d; C! v# c* r: t
# B$ M- z" a9 _8 ]
, R5 l0 s# u/ f

( P0 L, r! A" w    [23]   Rubio D, Garcia－Castro J , Martin MC, et al. Spontaneous human adult stem cell transformation[J]. Cancer Res, 2005, 65(8):3035-3039.
/ ~' z+ R3 T; h7 L' A# j2 q. U/ N3 k' g, }& a2 C/ d
6 Q' G, Y6 Q6 \( l
# a" ^; c% [* I
    [24]   Zhang FB, Li L, Fang B, et al. Passage－restricted differentiation potential of mesenchymal stem cells into cardiomyo-Cyte-like cells[J]. 　Biochem Biophys Res Commun, 2005, 336(3):784-792.