骨髓间充质干细胞治疗实验性肺动脉高压大鼠的疗效观察 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:30 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：何志旭，汪浩文，尚峰，严虎，杨燕，崔冬冰作者单位：贵阳医学院组织工程及干细胞研究中心，贵州贵阳  550004；贵阳医学院附院儿科，贵州贵阳  550004

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      【摘要】  　　目的：探讨骨髓间充质干细胞（MMSCs）移植治疗大鼠实验性肺动脉高压(PAH)的疗效及血流动力学指标的变化。方法: 取SD大鼠的骨髓，经贴壁筛选法体外培养并纯化MMSCs，移植前采用Hoechst 33342荧光染料标记；实验动物随机分为3组: MMSCs移植组（M组），单纯肺动脉高压组 (H组)和正常对照组 (N组)；M组采用野百合碱(50 mg/kg) 注射复制PAH模型成功后3周，经舌下静脉移植5×106/ml的MMSCs细胞悬液1 ml；H组复制PAH模型后3周，移植 1 ml L-DMEM细胞培养液，C组不作任何处理；饲养4周后，观察各组动物动脉血气指标、右心室收缩压、右心指数及肺小动脉血管的变化。结果: H组大鼠注射野百合碱21 d后，右心室收缩压、右心指数、管壁中膜厚度明显增高,但管腔面积与血管总面积比值及动脉血pH值、PaO2、 HCO3-明显下降；M组移植MMSC 28 d后，较H组右心室收缩压明显降低[移植组为（32.0±2.32）mmHg，模型组为（48.30±1.56）mmHg]，右心指数下降[移植组为(38.80±3.24)%，模型组为(45.10±3.43)%,两组相比P7 T) N& Z* M) Y  @/ z/ G4 F$ t& Z
      【关键词】高血压，肺性；骨髓间充质干细胞；血气分析；血流动力学
   　　　Therapeutic Effect of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells to) U% _- b9 `2 ^3 _

Experimental Pulmonary ArterialHypertension in Rats

　　HE Zhi-xu, WANG Hao-wen, SHANG Feng, YAN Hu, YANG Yan, CUI Dong-bing8 A3 c! O% \) o7 l; b
+ L7 |: Y9 _4 l3 z7 @% u) v
　　(Research Center of Stem Cell,Guiyang Medical College;Department of Pediatrics, the Affiliated Hospital of Guiyang Medical College,Guiyang 550001,China )
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　　［Abstract］Objective: To explore the change of hemodynamic parameter in bone marrow mesenchymal stem cells(MMSCs) transplantation to treat the experimental pulmonary arterialhypertension (PAH) in rats. Method: MMSCs cells were collected from bone marrow of SD rat's femoral and tibial bones,cultured and passaged in vitro,then purified by density gradient centrifugation and adhesive-screening method.60 healthy male Sprague-Dawleye rats（mean weighing 180±5 g） were randomly divided into 3 groups: normal control group (group C), MMSCs transplanted group(group M), PAH model group (group H ).The rats of the two latter group were given a single subcutaneous crotaline(50 mg/kg) to make the model of PAH. The rats of normal control group were injected respectively a single subcutaneous 0.9%NaCL(6 ml/kg).The three groups were fed in the same condition.After 3 weeks, 5106 MMSCs cultured in l ml phosphate-buffered saline were infused into the rats respectively in group Mby sublingual vein and 1 ml L-DMEM was did in group H .The index of right ventricle systolic pressure（RVSP）,right ventricle hypertrophy index, arterial blood gas analysis and the changes of small pulmonary blood vessel were observed after 28 day.Results: The administration of MMSCs 28 days after PAH the percent of viability is 100 in transplanted group, and it nearly completely prevented the increase in right ventricular systolic pressure（RVSP）with PAH alone (32.20±2.32 versus 48.30±1.56 mm Hg, respectively P2 f/ A4 M) G7 U% w6 }0 R
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　　［Key words］ hypertension,pulmonary； mesenchymal stem cells; blood gas analysis； hemodynamics6 r4 }% j- W1 @. B

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH) 是由多种因素所致肺循环阻力增高的一种严重综合征，分为原发性和继发性两种，原发性PAH较为罕见且其形成机制尚不清楚，继发性PAH则大多继发于缺氧、慢性阻塞性肺疾病以及肺血流量的增加或肺静脉压增高。PAH的病理机制是肺动脉血管重构，肺血管床的数量和面积锐减，肺循环阻力持续升高，常引起顽固性右心衰竭而死亡[1]。传统治疗PAH的方法以扩张血管为主，但对晚期PAH这一方法难以奏效。近期报道骨髓来源的间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells， MMSCs)具有分化形成内皮细胞，修复损伤血管及形成新生血管的能力[2]。本研究开始于2007年，设想使用MMSCs移植治疗大鼠PAH，重点观察肺血流动力学指标及肺血管变化情况，以评价其治疗效果。

　　1材料与方法
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　　1.1主要试剂
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　　野百合碱(cnotaline,美国Sigma 公司,批号063183), 低糖DMEM培养基(L-DMEM，美国Gibco公司）, 25﹪胰蛋白酶及5％胎牛血清（美国Hyclone公司），Hoechst 33342荧光染料、大鼠IgG1-FITC、IgG2a-PE单克隆抗体、CD45-FITC、 CD29-PE单克隆抗体、CD34-FITC和CD71-PE单克隆抗体（武汉博士德公司）。
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　　1.2大鼠骨髓MMSCs的分离、培养及鉴定采用4周龄清洁级SD大鼠，体重80~100 g。颈椎脱臼处死后，无菌条件下取双侧股骨，DMEM液冲洗骨髓腔获取骨髓细胞，收集冲洗液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，细胞沉淀中加入体积分数100 g/L胎牛血清的低糖DMEM培养液重悬细胞，进行细胞计数，接种于25 ml培养瓶中，37℃，5％CO2培养箱中培养。采用贴壁筛选法，每3 d更换新鲜培养液，待细胞80％融合后，2.5 g/L胰酶1∶2消化传代。倒置显微镜下观察细胞形态和增殖情况。流式细胞仪测定细胞表面抗原CD29、CD34、CD45及CD71表达进行鉴定。
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　　1.3MMSCs的荧光染色使用第5代以后细胞纯度较高的MMSCs，细胞50%融合后，吸出培养液，用PBS(pH∶7.4)洗涤细胞2次。加入终浓度10 mg/L的Hoechst 33342荧光染料,37 ℃孵育18 min。用PBS洗涤细胞2次,除去多余的染料。加入培养液支持细胞继续生长，48 h后荧光显微镜观察荧光标记情况，并收集细胞备用。采用Trypan-Blue 染色计数活细胞数。

　　1.4实验动物分组取8周龄健康、雄性SD大鼠90只，体重150~200 g，适应性饲养2周。随机分为3组: 正常对照组大鼠一次性项背部注射生理盐水(6 ml/kg)，单纯肺动脉高压组和MMSCs移植组各30只，后两组大鼠一次性项背部皮下注射crotaline 50 mg/kg，3组同等条件饲养。3周后移植组大鼠经舌下静脉注射5106/ml的MMSCs细胞悬液1 ml, 肺动脉高压组注射 1 ml L-DMEM液，正常对照组不作任何处理。饲养4周，观察大鼠活动、毛发、呼吸、食欲、体重及存活情况，采用Kaplan-Meier生存曲线分析。) N) y" N2 K# l! s% Z9 ?' J

　　1.5各项检测指标5 k1 w# H& T6 a* T9 f1 s
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　　1.5.1心功能及血气功能指标7 l* L; S( N# n  y
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　　大鼠以1%戊巴比妥钠(33 mg/kg)腹腔内注射麻醉后，从右颈外静脉插管至右心室，接压力换能器，经多导生理记录仪（RM-85型，日本光电公司）记录大鼠的右室收缩压(RVSP)，以此反映肺动脉收缩压，同时测定心率（HR）和平均动脉压（MPAP）。经左颈总动脉取血即刻行血气指标分析。, _: b' N+ M  P

　　1.5.2右心室肥大指数: D- L) t! T5 f9 o$ x

　　脱臼法处死动物，取出心脏，剪除心房，沿室间沟边缘分别游离右心室(RV)及左室加室间隔(LV S)。滤纸吸水后分别称重，以右心室肥大指数[RV/(LV S)]来反映右室的重量变化。
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　　1.5.3肺小动脉形态定量测定5 c& I% ?& D; u1 c+ V. ]9 W) Z# |

　　取左下肺组织块，常规石蜡包埋，在左肺门水平横切，组织切片行HE染色，用图像分析仪观察肺小动脉病变，观察肺小动脉结构，参照Barth的方法，采用Leica QWin V3图像采集分析系统测量与终末细支气管伴行的肺小动脉(直径

　　1.5.4荧光显微镜观察

　　荧光标记MMSCs移植后第7、14、21、28天取下的大鼠右下肺组织，常规石蜡包埋，切片（白片，厚约5 μm），荧光显微镜观察MMSCs迁移及定植情况。

　　1.6统计学分析　　9 F# E  _  i) n, @: a; s( b1 }2 z
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　　全部数据用SPSS13.0软件处理，所得结果用(x s)表示,3组间比较采用单因素方差分析及q检验，α=0.05。
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　　2结果2 Q; Y  c: ~/ h3 T+ ^, {# o
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　　2．1大鼠MMSCs的分离、培养和鉴定原代培养的大鼠骨髓细胞48 h后大部分贴壁生长，通过换液漂浮的血细胞被去除；72 h后贴壁细胞分裂增殖旺盛，呈巢状生长，细胞逐渐变为梭形。1周后细胞团互相融合，达90％以上时予以首次传代培养。经3次以上传代后混杂的细胞基本被清除，细胞均匀有序、为长梭形、类似成纤维细胞样，排列成漩涡状。流式细胞仪检测显示大鼠MMSCs：CD29、CD71为阳性，而CD45、 CD34为阴性。传5～7代MMSCs经Hoechst 33342荧光标记胞核着色，呈蓝色荧光，Trypan-Blue 染色计数活细胞数达85％以上。
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　　2.2动物一般情况及存活率模型组注射crotaline 2周后,动物活动明显减少、毛发直立、晦涩无光泽，呼吸明显急促,食欲下降；消瘦，体重较用药前及与对照组相比较都明显减轻；大鼠在复制模型第21天后相继死亡，在复制模型后第36天时死亡率高达80%，在复制模型后第42天死亡率达100%。MSCs移植组大鼠食欲逐渐恢复，体重渐增加，毛发有光泽，活动良好；在复制模型后第49天时生存率仍为100%。动物生存情况见图1。

　　2.3血流动力学指标大鼠注射crotaline第7天时，RVSP开始升高，心率增快，但与正常对照组比较尚无统计学差异;第14天时, RVSP增高和HR增快明显高于正常组(P
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　　2.4心功能指标大鼠注射crotaline第14天时，RV/LV S明显高于正常对照，并进行性发展到第28天左右；移植MMSCs后第14天，RV/LV S开始下降，第21天时与PAH组的差异才有统计学意义（P
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　　2.5血气分析PAH组第14天时血气指标开始恶化,与正常对照组相比，pH值、PaO2、 HCO3-明显下降，PaC02轻微升高；而MMSCs移植组第28天时pH 、PaO2、PaCO2、HCO3-与正常对照组接近，有显著改善(P0 k- r; `5 M; W' y9 Z6 \2 l

　　2.6肺血管管壁结构正常对照组肺小动脉管壁较薄、管腔内膜结构完整，无增生现象;PAH组可见肺小动脉管壁明显增厚、管腔明显缩小(图2);移植组大鼠肺小动脉管壁增厚及管腔狭窄程度较PAH组明显减轻(图3)。应用Leica QWin V3图像采集分析系统测量发现，与终末细支气管伴行的肺小动脉(直径
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　　2.7组织荧光显微镜观察Hoechst 33342标记的MMSCs经舌下静脉移植后迁移到肺循环中，但早期仅黏附在血管壁或分布于肺间质中，尚未向内皮分化或形成血管。移植后第14天发现荧光标记的MMSCs已围成一圈并分化成血管内皮细胞，移植后第21～28天MMSCs已形成连续的内皮细胞，构成新生的血管(图5)。

　　3讨论　　0 O/ @& ~0 Q5 k9 p+ O/ f
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　　近年研究显示，PAH的发病机理是由于肺血管重构所致[1]，因此，如何阻止及逆转肺血管重构是有效防治PAH的关键环节。既往针对PAH的治疗常采用扩血管疗法[3、4]，在发病早期可以缓解血管痉挛，但对于晚期PAH出现血管重构后，扩血管药物治疗无效。因此,只有逆转肺血管重构和扩大血管床横截面积的治疗方法才可能从根本上解决PAH病理基础。目前使用药物治疗血管重构尚无进展，而近年来兴起的干细胞治疗技术对于PAH的根治展现出一线曙光，使用干细胞修复损伤肺血管或者新生肺血管网有可能从根本上解决PAH的病理基础，实现PAH治疗效果上的重大突破。　　2 e$ w+ a2 Y- _

　　干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的原始细胞，可分为胚胎干细胞与成体干细胞。由于胚胎干细胞受伦理学等因素制约，其使用受到限制；而成体干细胞具有跨胚层“横向分化”的机制[5]，可取材于自身，从而避免了免疫排斥反应以及伦理道德等问题，故其应用技术的研究发展较快。在所有成体干细胞中，MMSC的研究和应用最为活跃。现有资料显示，MMSC可以分化为血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，并进一步形成新生血管，可用于治疗心肌梗死和血栓闭塞性脉管炎及糖尿病动脉闭塞症等多种血管闭塞型的病变，且显示出良好的疗效[2，6，7]。因此，推测将MMSC移植到PAH患者肺内有可能分化形成内皮细胞修复损伤肺动脉血管和形成新生血管网，逆转PAH病变。8 Z; @5 l1 Q9 y) }8 k

　　本实验证实同种来源的MMSC能够有效分化为血管内皮细胞，修复受损的肺动脉血管内皮；同时，能够形成广泛的新生血管网，既逆转了PAH的血管重构，而且有效地降低了肺动脉压力。实验动物移植MMSC后，生存状况明显改善，食欲渐渐恢复，活动增加，毛色顺滑、光亮；右心室收缩压明显降低、右心指数下降，肺小动脉的重建和超微结构的血气屏障、线粒体、板层小体等改变均有明显改善。这样就形成了肺小动脉的重建逆转—肺血气交换改善—肺超微结构及右心肥大改善—肺的结构和功能进一步改善的良性循环。研究还发现采用荧光标记的MMSCs在肺内定植且分化成血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，在肺内形成大量的侧枝循环。肺内血管床总面积增加，肺动脉重构得到有效逆转，从而肺的血气交换功得到恢复，这正是MMSCs移植治疗肺动脉高压的主要机制。此外，MMSCs移植治疗肺动脉高压的机制还可能与通过分泌促血管生成的物质如血管内皮(细胞)生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、粒细胞集落刺激因子等旁分泌机制,促进血管新生[8]。另一种可能的机制是干细胞分化过程中存在细胞融合现象[9]，即与相应组织细胞的直接接触可能是影响干细胞定向分化的关键因素。在干细胞参与组织修复过程中，这几种机制都有可能或者同时存在。本实验初步证实MMSC能有效修复肺动脉病变血管和降低肺动脉压力，同时没有明显的不良发应或并发症发生，该疗法为根治PAH提供了新的思路，具有重要的临床应用价值。
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　　[6]Miyahara Y, Nagaya N, Kataoka M, et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction[J].Nat Med,2006(4):459-465.2 ~! F7 E6 U* K( c1 t5 j- h
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