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作者：冯鹏，王 飞，李光来作者单位：山西医科大学第二医院，山西 太原 030001 ! \7 G; Z* C( q- M" D3 h
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【摘要】 目的：检测人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向神经细胞诱导分化前后培养液上清中神经生长因子(NGF)含量的变化，探讨BMSCs移植作用机制。方法：从健康志原者髂骨处抽取骨髓5 mL，体外分离、培养、扩增后用400 ng/L音猬分子(SHH)、0.5 μmol维甲酸(RA)和5 μmol Forskolin(Fn)组成的诱导体系进行诱导。使用ELISA法检测1 d，3 d，5 d，7 d的hBMSCs培养液上清中NGF的浓度，并且对比诱导前(12 h，1 d，3 d)后(12 h，1 d，3 d)的上清液中该物质浓度的变化。结果：hBMSCs培养液中含有NGF，随培养时间的延长，培养液中NGF的浓度增加；hBMSCs后期诱导液中也含有NGF，且诱导后各时间点浓度均明显高于诱导前(P＜0.01)。结论：hBMSCs在贴壁培养以及向神经细胞诱导分化过程中，均可向外分泌NGF等神经营养因子，且诱导后分泌量明显增加。
5 l* ?8 @0 C2 |- P, K' `3 |9 t 【关键词】骨髓间充质干细胞；上清液；神经营养因子；分泌作用
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Experimental study on expression changes of NGF during the differentiation of human bone marrow stromal stem cells into nerve cells* V% `8 j2 i' R; t
3 G) K- Z0 @3 _" LFENG Peng，WANG Fei，LI Guang-lai
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. N/ W; M& S: ~% _5 F. N(The Second Hospital ofShanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)2 e: i' g" v" [7 V' S% G; Y/ v$ v
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AbstractObjective：To detect the expression of NGF in supernatant of inducing medium from hBMSCs to nerve cells，and explore the mechanism of BMSCs transplantation.Methods：hBMSCs harvested from adult normal human marrow，then were passaged and purified in culture medium.hBMSCs were passaged three times before experiment，then purified hBMSCs were induced by SHH(sonic hedgehog，400ng/L)，RA(retubiuc acids，0.5 μmol) and Fn(forskolin，5 μmol).The concentration of NGF in supernatant was detected by ELISA on 1 d，3 d，5 d，7 d in Supernatant of hBMSCs culture medium，then we analyzed and compared the concentrations of NGF between before and after induction at three time points(12 h，1 d，3 d).Results：NGF was tested in supernatant of hBMSCs culture medium.Along with time prolonging，the concentration of this neurotrophic factor increased.We had also found NGF in supernatant of inducing medium，moreover，the concentration at every time point after induction was higher than before(P＜0.01).Conclusion：hBMSCs can secrete NGF both in adherent culture and inducing culture，furthermore，the secretion increased significantly in latter culture.2 j" Y9 u3 F }! K: ~( n
1 @0 h; O& E% z& x: u! K7 \/ K5 k, mKey wordsbone marrow stromal cells；supernatant；neurotrophic factors；secretion function! I4 Y% U% C6 V4 h( [" |7 x
9 H" I& v0 h6 R& p大量的实验证明在体内环境中BMSCs能被诱导分化为神经细胞，并能够一定程度改善各种神经损伤动物模型的神经功能，这充分肯定了BMSCs在神经系统疾病尤其是脑卒中疾病治疗中的应用价值。本研究通过使用音猬分子(SHH)、维甲酸(RA)和Forskolin(Fn)等组成的诱导体系，诱导人骨髓间质充质干细胞(hBMSCs)向神经细胞分化，观察诱导前后培养液中神经生长因子(NGF)含量的变化。探讨骨髓间质充质干细胞(BMSCs)在移植治疗各种神经损伤中发挥作用的机制。, W0 i/ ~( I# U1 U
& }5 A# [ A# v) o0 E( ~1资料与方法
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1.1试剂; D; d I1 X" _, C
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低糖DMEM(gibicol公司)；SHH(R&D公司)；RA(Sigma公司)；Fn(Sigma公司)；胎牛血清FBS(杭州四季青)；二甲基亚砚(DMSO)(华美公司)；人NGF定量ELISA检测试剂盒(R&D公司)。- {2 C( T; N3 S% L- A2 M
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1.2方法
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1.2.1hBMSCs的分离培养及传代培养和获取上清/ c/ M) I% Z. {
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骨髓由健康成年志愿者损献，常规无菌条件下从髂后上棘行骨穿抽取肝素化骨髓5 mL。以密度梯度离心加贴壁培养方法分离，以含20％胎牛血清DMEM培养基进行原代培养，置于50 mL培养液瓶，于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中常规培养。3～4 d后首次换液，后每2～3 d换液1次，换液时可轻轻吹打瓶底尽量去除未贴壁细胞(首次换液时除外，以免影响细胞贴壁)。每天在倒置显微镜下观察细胞形态及生长速度。待细胞至90％以上融合时准备传代。加入经37℃温育的胰蛋白消化液1～2 mL，37℃消化1～2 min，镜下观察细胞体开始回缩后移走消化液，加完全培养基终止消化。用吸管反复吹打瓶底细胞至完全脱落，吹打均匀，按1∶3比例分瓶培养。每天在倒置显微镜下观察细胞形态及生长速度，传代培养至第5代时，分别收集1 d，3 d，5 d，7 d上层培养液，以2 000 r/min离心10 min，过滤后收集上清待检测。
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6 s% c4 e2 f1 [4 B: W) f1.2.2SHH及RA等诱导hBMSCs分化
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取第5代的hBMSCs按1∶3的比例接种于6孔培养板内并调整密度为105/mL，分为诱导前、后两组，各组又分为12 h组、1 d组、3 d组三个亚组，各孔先以含血清的DMEM培养基培养24 h使细胞贴壁，然后诱导前各组加入2 mL的只含MDEM的无血清培养基，诱导后各组加入2 mL含DMEM、SHH、RA、Fn的无血清培养基。最后分别按照以上各时间点获取上清液待测。, |4 G4 [2 a1 A7 |4 h* D8 `
& Y6 H: D7 N2 K0 B) i! H+ ^1.2.3ELISA检测培养液和诱导液上清的NGF浓度" L% v) e4 l5 M$ F% x A
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检测采用人NGF定量ELISA试剂盒，按说明逐步操作，首先依照标准品浓度(标准孔8孔，浓度依次降低)建立标准曲线，在每个待测孔中加入已激活的待测样品(上述每组上清液各5个孔)100 μL；再将反应板充分地混匀后置于37℃120 min，洗板后在每孔中加入第一抗体、酶标抗体以及底物各100 μL，置37℃15～20 min；最后加入50 μL的终止液混匀在450 mm处测吸光值(OD值)。根据OD值在标准曲线范围内确定检测各样本NGF浓度。6 ~* U$ T* J5 m! P2 {! x
. s' V. x6 Y' f* X1.3统计学分析+ U5 y2 N0 {1 R7 R2 n& X
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全部资料采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，各数组均以x±s表示。使用标准曲线计算诱导前、后(12 h，1 d，3 d)各组中NGF的浓度，采用方差分析或t检验进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。
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2结果: F* K* J% j: M4 E( }1 s
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2.1hBMSCs培养上清液中NGF的ELISA检测3 D3 B( Q2 s% O$ q8 i0 b2 u
+ r8 f, s' w/ N4 c; P8 j& YhBMSCs培养液中可以检测到NGF，而且随时间延长培养液中NGF含量增加(见图1)。! R: a+ H/ J: N/ n1 w( r. W8 @6 J
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图1不同时间点hBMSCs培养液上清中NGF的含量0 k! P' ?4 Y" m! T3 k7 N7 V* ]4 y
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2.2hBMSCs向神经细胞诱导分化前后上清液中NGF的ELISA检测
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; C, o' D' |+ o q诱导前后的上清液中均可以检测到NGF的存在。与诱导前相比诱导后各时相该神经营养因子的含量明显增多(P＜0.01)；诱导前、后1 d组和3 d组中NGF的含量相比诱导前、后12 h明显增多(P＜0.01)；诱导前、后3 d和1 d组中NGF的含量相比较差异无显著性(P＞0.05)(见表1)。表1hBMSCs向神经细胞诱导分化不同时间点上清液中NGF的浓度变化 （略）
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3讨论% Y0 K7 c- \# T% x- n+ k/ t1 i
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众所周知，BMSCs作为人类治愈中枢和外周神经系统疾病的福音，已被广泛应用于各种自体细胞移植的临床研究，并获得了一定的效果［1，2］。但是到目前为止关于BMSCs的移植治疗的具体作用机制仍是不甚清楚，长久以来，多数研究者认同BMSCs移植后在体内被诱导分化为神经细胞的“细胞替代机制”是治疗各种神经系统损伤的不二法门。Hofstetter［3］和Chopp［4］报道BMSCs移植到损伤脊髓后，促进脊髓损伤大鼠后肢的运动功能的恢复，BMSCs在脊髓中存活、迁移，引导神经微丝和5-羟色胺染色的神经纤维长入。该作者认为BMSCs在体内环境诱导下向神经元或神经胶质细胞横向分化，发挥神经传导或支持作用以达到神经功能的修复，但是目前很多人对这种观点产生了怀疑。因为一方面虽然在体外实验中使用种类纷杂的诱导剂或诱导方案使BMSCs向神经元样细胞分化的比率较高，但是诱导过程中还是不可避免地有较多的BMSCs凋亡或者死亡，BMSCs也较难诱导成为成熟的具有分泌神经递质和电生理功能的神经细胞，另一方面体内实验的诱导分化率远较体外实验的低，依靠这些少量的不成熟的细胞恢复神经功能可能性似乎较小。
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近几年一些研究者开始提出这样的假说：BMSCs等细胞植入能改善神经功能的机制是多角度、多层次的，可能是植入细胞在局部替代坏死的神经细胞；抑或是植入细胞在局部产生多种促进分化、增强的调控信号或抑制神经细胞凋亡的各种细胞因子，从而促进了局部损伤的修复。并且认为植入细胞的分泌作用要强于局部替代作用［5］，这就是“饲养理论”假说。这种假说认为BMSCs本身是一种支持细胞，能分泌多种生长因子，能对多种组织(包括神经组织)起支持(饲养)作用［6，7］。
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# [4 }/ F9 G8 e, _8 G/ QBMSCs作为一种多潜能分化细胞，究竟如何发挥“饲养”作用？能够分泌何种具有神经修复和保护功能的细胞因子？本文两个同期实验发现：在体外使用不同时间点的后期诱导液上清能够促进BMSCs向神经细胞诱导分化；而体内环境下，BMSCs培养液上清可以促进脑缺血大鼠模型体内原位神经前体细胞的增殖和分化。这些均从侧面反映了在BMSCs诱导前后的上清液中存在有促进神经修复和再生以及神经保护作用的物质。与此同时，近两年的一些报道提及BMSCs可以表达NGF、BDNF等神经营养因子的mRNA［8，9］。综上所述，为了进一步弄清“饲养”作用的具体机制，我们提出对BMSCs诱导前后的培养液进行研究，观察其中是否有NGF的存在及其变化。NGF是重要的神经营养因子，对神经组织有多方面的保护作用：在神经发育的早期可以促进神经元的分化并诱导神经元的定向生长、影响神经纤维支配效应细胞的密度、促进神经元胞体和突起的生长、控制神经元存活数量等作用，在成熟期可以具有维持感觉神经元和中枢神经元群的功能，促进成熟神经元树突和轴突之间的相互联系作用，这些对于神经损伤后神经网络的重建和修复具有十分重要的意义。/ ~4 X+ J# w! q# \
2 o6 E2 u- \# F+ C8 n- J( U本研究结果显示：hBMSCs培养液上清中的确存在有NGF，随着培养时间的延长，该种神经营养因子的浓度也随之增加。这表明hBMSCs可以在不添加任何诱导剂的条件下分泌NGF，其浓度随培养时间增加，很可能是由于hBMSCs在贴壁培养的过程中不断增殖和成熟的结果。此外，本研究还显示使用SHH、RA、Fn组成的诱导体系对hBMSCs向神经细胞进行诱导分化的过程中所产生的NGF的浓度要高于分化前，这说明诱导体系在促使hBMSCs向神经前体细胞或者神经细胞分化过程中，进一步加剧了细胞的分泌作用，并且随着诱导时间的延长，NGF的含量随之增加，直到第3天时，在上清中的NGF的含量不再增加，而这很可能是因为诱导剂消耗殆尽所致。虽然本研究证实了在hBMSCs诱导分化前后都会有NGF的分泌，但是究竟是何种机制导致添加诱导剂后NGF的分泌增加以及是否还有其他物质分泌？还有待进一步研究考证。此外，同期实验以及最近其他研究者的研究［10～12］中所证实的BMSCs培养液上清的体内、体外作用中，NGF是否是主要参与因子及其具体作用机制还未可知。
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发表于 2009-3-3 12:31
发表于 2015-6-16 16:43
