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作者：张珊红 郭亮 龚卫琴 张航向 李源作者单位：第四军医大学西京医院老年病科，陕西 西安 710032 6 l8 _# E0 a F7 a/ [2 U# W$ `2 M
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" _# w: ^% M9 f1 q$ O 【摘要】 目的 观察骨髓间充质干细胞（MSCs）经静脉移植在大脑中动脉缺血再灌注（MCAO）大鼠脑内存活并分化为神经元样细胞。方法 常规方法分离、培养大鼠MSCs，根据Aspey方法制成MCAO模型，经尾静脉注射3×106溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记的大鼠MSCs ，28 d后处死大鼠，取脑组织行免疫荧光检测。结果 共聚焦显微镜下观察到MSCs移植后脑梗死灶边缘聚大量BrdU阳性细胞，少量神经元特异性烯醇化酶（NSE）和BrdU双染细胞。结论 经静脉移植的MSCs可移行至MCAO脑梗死灶周围并分化为神经元样细胞。 ' m1 ]$ M5 q, f( V, r, K, A
【关键词】骨髓间充质干细胞；细胞移植；大脑中动脉缺血再灌注* C+ O/ ? R7 K/ Q% W4 |2 q: [
Mesenchymal stem cell survival and differentiation into neuronlike cells in the brain of middle cerebral artery occlusion: y+ z/ x7 E+ ~8 [
* Q* D9 {! Y8 x t+ [ ZHANG ShanHong, GUO Liang，GONG WeiQin, et al.
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* u, _) |' N( l- Q$ J Department of Geratology, Xijing Hospital of Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, Shanxi, China
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7 z/ r% j. o( e' v【Abstract】ObjectiveTo investigate the survival and differentiation into neuronlike cells of mesenchymal stem cells (MSCs) by intravenous transplantation in the brain of middle cerebral artery occlusion (MCAO) rats.MethodsMCAO model were made by Aspey method, MSCs were isolated, cultured, labeled with BrdU and transplanted into the rats of MCAO. 28 days after, the rats were killed to obtain the brain tissue detected by immunofluorescence.ResultsMost of MSCs expressing BrdU and a few BrdU and neuronspecific enolase (NSE) doublelabeled cells were observed in the edge of the occlusion brain.ConclusionsIntravenously transplanted MSCs can survive and differentiate into neuronlike cells in the brain of MCAO rats.
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. V$ o. r, s, }, f% i1 [/ \【Key words】Mesenchymal stem cell; Middle cerebral artery ischemia and reperfusion; Cell transplantation
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目前的研究认为，神经元细胞是不可再生的细胞，一旦发生损伤就无法修复，这是临床上神经系统创伤和神经系统退行性疾病治疗效果不佳的主要因素。近年来研究发现，骨髓间充质干细胞(MSCs)在特定条件下可以表达神经元的表面标志物，提示MSCs有分化为神经元细胞的潜能〔1〕。但是，MSCs定向诱导分化为神经元样细胞的条件及机制尚不明了，它在神经系统疾病病变组织中维持稳定和参与修复的作用机制不清，MSCs的示踪、植入的途径、移植后细胞的鉴定等问题还有待于进一步研究。本研究仅观察MSCs经静脉移植用于脑梗死治疗的可行性。
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1材料与方法
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1.1动物
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雄性SD大鼠8只，体重280～320 g，鼠龄16 w左右，购自第四军医大学实验动物中心。) C& [- g0 g/ _- Y Z
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1.2大鼠MCAO模型的制作
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参照Aspey等的方法〔2〕，大鼠麻醉后取颈正中切口，钝性分离暴露右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉，于颈总动脉分叉下方剪一切口，将一末端用酒精灯烧成圆头的尼龙线（30，Ethicon Inc，Japan）插入颈内动脉17～18 mm，结扎颈内动脉。阻闭血流120 min后抽出尼龙线，恢复灌注,麻醉苏醒后，将动物放回鼠笼，自由饮食。. _# e$ i5 n& q
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1.3大鼠MSCs的分离、培养和细胞移植
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参照Kadiyala等〔3〕的方法略作改进，取16周龄体重约为120～160 g的雄性SD大鼠，拉髓处死，用75%的酒精浸泡5 min后，固定于解剖板上，剪开皮肤取两侧股骨及胫骨标本，剔除肌肉及软组织，将股骨干从中间剪断，用5 ml注射器抽取含100 U/ml肝素的生理盐水约10 ml反复冲洗骨髓腔，将收获的全部骨髓用注射器反复抽吸，以打散组织成为细胞悬液。收集细胞悬液并将其转入15 ml离心管中4℃ 1 000 r/min离心5 min。弃上清液及脂肪层。以5 ml 0.01 mol/L PBS洗涤，洗涤后的细胞以PBS稀释成4107/ml的悬液，取5 ml小心地叠加到密度为1.073的percoll淋巴细胞分离液上，2 000 r/min离心30 min，以直头吸管在界面取单个核细胞层，加入5 ml 0.01 mol/L PBS，1 000 r/min离心5 min，弃上清，以106/cm2密度接种于培养瓶中，加入含15鸖和100 U/ml青、链霉素的DMEMLG培养基，置于孵箱中培养，36 h后首次换液，去除未贴壁细胞，以后每3～4 d换液一次。待贴壁细胞达80%～90%融合时，以0.125%胰酶消化，按1∶3比例传代。在移植前48 h，在培养液中加入10 μmol/L的BrdU（博士德公司），继续培养48 h，弃去培养液以PBS洗涤，大鼠尾静脉注入约含3106 MSCs悬液1 ml。
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1.4免疫荧光鉴定
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将动物于细胞移植后28 d以3％戊巴比妥钠3 ml腹腔注射麻醉，开胸，经主动脉插管，先快速灌注生理盐水100 ml，再注入4％多聚甲醛固定液400 ml，先快后慢，在1.5 h内滴完。开颅取脑，置于20％的蔗糖溶液（4℃）中24 h至沉底。脑组织以LEICA 1800恒冷箱切片机冠状连续切片，片厚14 μm，常规贴片。取脑片浸入2 g/L HCl中37℃ 30 min，0.1%胰酶37℃ 20 min，滴加小鼠抗BrdU抗体(1∶1 000，博士德公司)和兔抗NSE抗体(1∶200，博士德公司)4℃孵育48 h，然后加入FITC标记的抗小鼠IgG(1∶500，sigma公司)和Texas red标记的抗兔IgG (1∶500，sigma公司)，避光孵育2 h，以上每一步骤后均以PBS 充分漂洗3次，缓冲甘油封片，激光共聚焦显微镜(Olympus Fluo View 300 IX 70)观察拍照。
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2结果' p% S( k0 {$ Y& Q
9 q/ s. Q; H# Y- |! G1 R 2.1MSCs分离培养结果
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原代培养的MSC呈圆形，胞体透亮，折光性好，与骨髓单个核细胞混杂。细胞接种36 h后可见少量细胞贴壁，呈梭形，类似成纤维细胞，成集落样生长，以后逐渐增多。2 w左右，细胞融合成片。传代后细胞生长速度加快，约3～5 d可传代一次（图1）。8 r& i) s8 F% @
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2.2MSCs移植后的组织化学变化
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5 z# |! ~. e- d) l2 \ MSC移植入MCAO大鼠体内1月后，荧光显微镜下可见脑梗死边缘聚集大量BrdU阳性细胞，而健侧脑组织中BrdU阳性细胞数量相对较少。极少量BrdU阳性细胞表达神经元特异性抗原NSE（见图2，箭头所示为BrdU和NSE双阳性细胞）。; }8 b- G0 |7 ~ _; ]" O6 M
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3讨论' ?3 H8 u C/ K) E
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近年来对MSCs用于神经系统损伤的治疗进行了不同方面和不同程度的研究：Woodbury〔1〕等在体外成功地诱导MSCs转变为了神经元样细胞，Kopen等〔4〕发现MSCs注射到新生小鼠脑内可分化为神经元和神经胶质细胞，Brazelton等〔5〕和Mezey等〔6〕分别通过不同的方法观察到在体内条件下，外源的MSCs在小鼠脑内可转变为神经元，这些均提示MSCs可以用于中枢神经损伤或退行性疾病的治疗。研究还发现，MSCs移植于受损的动物脑组织中，可以明显改善或加快神经损伤动物的神经功能恢复〔7〕。
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其机制可能有：(1)MSC移植入动物体内后，在脑组织中存活并分化为神经元细胞和神经胶质细胞，可能替代或代偿发生坏死和凋亡的细胞，从而改善大鼠的神经功能。(2)与在骨髓中的作用相似，MSCs进入脑组织内部可能提供营养和支持作用，分泌和促进神经细胞分泌神经细胞修复再生所需的营养因子，如神经营养因子和血管内皮生长因子、神经生长因子、肝细胞生长因子等，从而改善神经细胞的营养和代谢作用，促进MCAO大鼠神经功能的恢复〔8〕。(3)MSC进入体内后，在脑组织损伤微环境的作用下，可以分泌营养因子，从而减少神经细胞凋亡、促进脑组织中血管内皮干细胞和前体细胞的增生〔9〕。# M {2 ~/ f% M/ i( j3 ?6 y7 R
" G: }6 Q. C0 u8 u$ J( ~* [4 k- r本实验通过检测发现，经静脉移植MSC后28 d于脑梗死灶周围发现大量BrdU阳性细胞，而健侧脑组织中BrdU阳性细胞相对较少，由此说明，MSC可以通过血脑屏障进入MCAO大鼠脑组织内发挥作用，而且MSCs有选择性分布的趋势。MSCs选择性分布于梗死组织的机理尚不清楚，可能与脑梗死后缺血神经细胞分泌黏附分子等细胞因子表达水平的变化有关〔10〕。总之，MSCs经静脉植入可以在MCAO大鼠脑梗死灶周围存活，少量MSCs可分化为神经元样细胞。因此，MSCs可能成为神经系统疾病治疗的细胞载体，但这些细胞能否与周围神经元细胞形成有效的神经回路，发挥替代或代偿作用尚有待于进一步研究。1 m3 T1 B W. a
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9 w! |# M. r3 D5 W5 b% m4 v" ] z基金项目：陕西省科研发展计划（2002K10G4） |
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发表于 2009-3-3 12:32
发表于 2015-5-22 10:51
