羊骨髓间充质干细胞体外培养生长及诱导分化特性的观察

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作者：曹希武作者单位：河北省沧州市人民医院骨三科
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          【摘要】  目的：对羊骨髓间充质干细胞加以诱导分化，并分析其作为组织工程瓣膜种子细胞的可行性，探讨体外培养羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）和一般细胞生物学的特性。方法：采用成年山羊10只，麻醉后分别于股骨大转子穿刺抽取羊骨髓标本10ml，采用比重为1.07g/ml的淋巴分离液，接种于无菌的培养瓶中，利用多孔培养板，取第二、三代骨髓间充质干细胞，加入LG-DMEM条件培养基进行体外定向诱导分化。对诱导后培养的骨髓基质的间充质干细胞（MSCs）进行细胞生长测定及形态观察。结果：培养后的骨髓间充质干细胞和血管间质细胞形态相似，呈梭形或多角型，均24小时内贴壁，3～4天铺满瓶底。诱导分化后的骨髓间充质干细胞与血管间质细胞上清液羟脯氨酸含量基本相似，且生长曲线也相同。培养的MSCs粘附贴壁呈纺锤状，并有多个突起，潜伏期一般为24小时，接种后第8天MSCs生长逐渐缓慢，进入平台期。结论：诱导分化后所培养的间充质干细胞，具有独特的增殖和表型特征，是合适的组织工程瓣膜间质种子细胞。
4 Q+ z/ v- \* U3 {- v% d+ h          【关键词】诱导分化  组织工程  羊   骨髓间充质干细胞  体外培养3 V. L0 ~; b/ I9 P3 F' }, {
                  资料与方法
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* p: c: O( n- Z5 S一般资料：本组实验采用成年山羊10只。主要试剂为水合氯醛、安定、粉剂DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、淋巴分离液、多聚甲醛（PFA）、免疫组化学试剂盒等。 主要仪器包括细胞培瓶、24孔细胞培养板、1ml冻存管、超净工作台、离心机、CO2培养箱、倒置相差显微镜、振荡器等。
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实验方法：①把成年山羊麻醉后，固定四肢，术区剃毛，常规消毒铺巾。分别于股骨大转子穿刺抽取肝素化骨髓10ml，稀释、离心、弃上清及脂肪层，其余细胞用LG-DMEM无血清培养基重悬，铺于等体积的Percoll淋巴细胞分离液上，离心收集单个核细胞，消化传代培养。取第二、三代骨髓间充质干细胞，加入LG-DMEM条件培养基进行体外定向诱导分化。对诱导后的细胞进行形态观察、免疫组化鉴定并绘制生长曲线。上述10只山羊抽取骨髓后，无菌条件下取大隐静脉，剥去静脉外膜，剪成1～3mm，贴壁法培养，消化传代。取第3代骨髓间充质干细胞与血管间质细胞，分别以5104L密度接种于24孔培养板，常规孵育96小时。每孔各吸取培养基0.5ml，测定两种细胞上清液中的羟脯氨酸含量。完毕后用胰蛋白酶消化对处于数生长期的细胞加入冻存液，调整细胞密度为7109/L置于液氮中，1周后复苏，计算两种细胞的存活率。反复种植3次，每两次间隔24小时，第4天各组均取出2份样本，扫描电镜观察。第7天向其余标本中加入四唑盐，采用酶联免疫检测仪490nm处骨髓间充质干细胞组、血管间质细胞组的吸光度值，比较两种细胞在去细胞主动脉瓣上的生长能力。②羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）的生长曲线测定：将细胞悬液接种于24孔培养板上，每孔1ml，每天取贴壁细胞的计数，连续8天计算均值，描绘细胞传代后生长曲线。③羊骨髓间充质干细胞的冻存：取生长期的羊BMSCs细胞（冻存前全量换液），用0.25%胰蛋白酶消化，离心收集，加入等量的冻存液，吹打均匀，以1ml/支移入无菌冻存管密封在-20℃，2小时后，移至零下80℃深低温冰箱中冻存8～10小时，然后移入-196℃的液氮中。④冻存羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）的复苏。取出冻存管后，迅速投入加有37℃温水的烧杯中移入超净操作台，然后将融化的细胞悬液移入离心管，加入完全培养液10～15ml，吹打均匀，加入完全培养基以1105个/ml接种于50ml培养瓶中，24小时后全量换液1次，以后常规培养。
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统计学方法：统计学软件采用SPSS10.0，计数资料用X2检验。
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结果
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9 L. A; M' ?2 H1 Z3 }0 _培养的骨髓间充质干细胞黏附贴壁，均呈纺锤状，并有多个突起。一般细胞接种密度下的骨髓间充质干细胞，三代细胞生长周期基本一致，均为接种培养后第2～3天，但生长较缓慢，为生长迟滞期。3 天后细胞生长有快速增长过程，达到对数生长期，在7～8天时，细胞总数达到最高值，为生长平台期，其后生长速度逐渐减缓。免疫细胞化学染色后，显示所培养细胞的细胞膜抗原CD44均呈阳性。羊骨髓间充质干细胞的特征，是原代细胞在培养瓶底散在分布，呈圆形，胞体透亮，折光性好，很多的骨髓造血细胞混杂在内。在第9天换液后，悬浮细胞基本祛除，瓶底聚集生长的细胞形态多不规则，15天可见多处聚集生长的细胞群脱落，中心细胞为梭形，可见多个突起。根据生长情况每4～7天进行1次传代，传代细胞接种后 2～4 小时即迅速贴壁、伸展，6～10 小时左右活细胞基本完成贴壁。传代细胞的生长较原代较快，接种后7天即可铺满整个培养瓶底，冻存复苏的活细胞率大约为95.6%。羊骨髓间充质干细胞的生长曲线测定表明，其三代细胞生长周期基本一致，接种培养后，开始生长较缓慢，为生长迟滞期；3天后细胞生长加速，达到对数生长期；7～8天细胞数达最高值，为生长平台期，其后生长速度减缓。光镜下观察显示免疫细胞化学染色后的细胞膜抗原CD44有阳性表达。' G  m! X: ~$ u- J8 k, k" b
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讨论1 u$ _# T8 E1 l* c
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本组实验结果显示，经过传代后即可得到纯度较高的羊骨髓间充质干细胞（BMSCs），所培养细胞的干细胞生长曲线也基本一致，这说明培养的细胞不是骨髓中的造血干细胞，来源应为同一干细胞，因为所培养细胞的细胞膜抗原CD44阳性。综上所述，本组实验结果证实了所培养的细胞是处于未分化阶段的骨髓间充质干细胞，具有较强的遗传稳定性和增值能力，可随冻随取，适于建立种子细胞库，是作为骨组织工程种子细胞的合适选择。5 {1 z, W7 J( c4 `, w8 Y! N" P
          【参考文献】
9 `4 x% X3 M3 G+ X$ `1  顾春虎,王云雅,李亮,等.诱导分化羊骨髓间充质干细胞作为组织工程瓣膜间质种子细胞的可行性.中国组织工程研究与临床康复,2007,11(20).
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0 y+ C! U) E& n8 a# ~    2  曹希武,苗军.羊骨髓间充质干细胞的体外培养及临床鉴定分析.中国社区医师,2008,10(9):11.