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为什么脂肪细胞不贴壁?     [复制链接]

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楼主
发表于 2011-2-23 21:02 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
本帖最后由 llhxq09 于 2011-2-23 21:28 编辑 $ [0 H. ?& n. d/ V/ C" M
; j( o& n3 {% C) b! a. W! R
1、取约5ml的脂肪(两个剖腹产),去血管和间质组织后,剪成1mm×1mm×1mm大小。2、加0.1%的1型胶原酶10ml放在37度温箱中50min,之后中用L-DMEM(10%胎牛血清)10ml中和。3、用100目过滤器过滤,滤液用50ml离心管离心1500转10分钟。之后将上清倒掉,将细胞用L-DMEM吹打,制成悬液后再1500转离心10min,之后再离心一次。5、将最后一次离心后得到的细胞制成含10%胎牛血清的5ml的L-DMEM悬液,加入25平方米的培养瓶中,之后放入CO2、37度培养箱中。5 z  ^( I2 J. P2 q- Z
这是我做的步骤,但是16小时后我看原代细胞很密,不知道是什么细胞,也可能红细胞多,而且没有贴壁,到底怎么回事啊?我已经试好几次,可是问题培养不出来!求大家帮帮忙
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沙发
发表于 2011-2-24 08:35 |只看该作者
    我在你的第三步时没有过滤,用的是1200rpm离心5min,之后液体是分为3层的,有文献报道上层是脂肪细胞层,中层是脂肪组织层,底层是脂肪干细胞层和少量的成纤维细胞以及红细胞层,我因为要分离脂肪干细胞,所以我要的是下层,因为我没试过你那转速和时间,不知道脂肪细胞也会不会沉在下面或者不分层,但可以肯定的是你的这种方法得到的细胞肯定非常的不纯,需要更多的纯化过程,细胞不纯对于后续的实验是非常麻烦的。最近我也要尝试做脂肪细胞的分离,我看到的文献很多也都是离心时转速不能过大,离心后后取上层的脂肪细胞层,再进一步做纯化,/ p; w) Y( Z: A& L# Z
      上传一篇文章给你,说得很详细,希望对你有帮助……
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发表于 2011-2-24 09:51 |只看该作者
好的,非常感谢

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板凳
发表于 2011-2-24 10:37 |只看该作者
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噢,我要的是脂肪干细胞,可能没有表达清楚

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报纸
发表于 2011-2-24 20:02 |只看该作者
哦,这样的啊,那给你介绍一下我的经验啊。我在最后一次离心重悬后,只加了少量的DMEM,12小时后补液,但此时细胞也没有看到明显的贴壁,当初也以为失败了,但36h后却发现了明显的成纤维样的细胞贴壁,所以啊,你再等一段时间,细胞很可能会贴壁……
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地板
发表于 2011-2-24 22:05 |只看该作者
谢谢啦,不过我今天半量换液时,已有41小时了,没有见贴壁。

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发表于 2012-4-1 16:27 |只看该作者
谢谢分享啊

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发表于 2012-4-2 21:45 |只看该作者
请问楼主的问题解决了吗?我最近也在养脂肪干细胞,遇到了和楼主同样的问题,不知道问题出在哪里,请高手赐教!
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发表于 2017-11-30 18:12 |只看该作者
想下载附件,没有威望。。。

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发表于 2017-12-13 12:43 |只看该作者
我之前做脂肪的实验使用消化酶是胶原酶和分散酶  消化时间30分钟, 后续没有做过滤 直接接种培养的  细胞生长很好 ,另外你最后说细胞很密确没有细胞贴壁, 是不是细胞中含有较多的红细胞,形态上很好判断,如果是红细胞的话 可以考虑在最初处理样本时进行清洗去除红细胞,也可以考虑最后用红细胞裂解液进行处理,希望对你有帮助
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