国内iPSC近期研究扫描

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2010年后半年与2011年初，国际干细胞界关于iPSC的研究的一个突出现象是多项密集研究发现iPSC在表观遗传和基因谱上的内在缺陷，同时出现了一些跨细胞谱系直接转分化的成功尝试，使得人们对iPSC本身的价值产生了一些疑问。iPSC本身的研究在走过单因子、蛋白诱导、小分子以及mRNA等一系列技术突破之后，比较明显的走向之一是利用某些疾病的遗传因素诱导分化具有特定疾病表型的iPSC系。iPSC的下一步走向似乎不是很确定，尤其是在接近原始多潜能状态、诱导效率、排除成瘤性、以及疾病模型应用等方面能有什么突破，尤其是作为细胞治疗的诱导分化和安全性实用性方面的问题，受到更大的质疑。
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5 x; o2 c0 X! h+ a" m中国干细胞界的一些主要iPS研究者则在这段时间发表了一些他们自己的研究。尤其是今年以来，中科院动物所周琪实验室、北京生命科学院高绍荣实验室、中科院广州健康研究所裴端卿实验室和北京大学生命科学院邓宏魁实验室，分别发表了带有各自实验室传统方向的iPS相关文章，从某种角度来看，iPS仍是这些国内主流干细胞实验室的重点方向。截止2011年3月份，这几个实验室共发表6篇iPS相关研究。大致归纳一下，具有几个特点。一是诱导因子方面，多采用单因子或加小分子，以及个别因子的替代物；同时一些研究开始触及iPSC表观遗传等可能的机制。不过各自的研究也有各自实验室的特点，并承续了过去他们各自的一些相关研究。
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3 N. l/ ^7 o8 {$ U+ R& f周琪实验室今年发表了两篇相关文章，一篇是与丁盛实验室共同发表在Stem Cells上的。丁盛实验室提出一种新的小分子，结合外源性Oct4以及TGF-b inhibitor将小鼠胚胎成纤维细胞重编程为iPSCs，' C8 j/ I' a$ G. e0 h
结合周琪实验室的四倍体补偿iPS小鼠技术证明这些iPSC的全能性。这个小分子AMI-5是一种protein arginine methyltransferase inhibitor，由此他们推断protein arginine methylation参与参与重编程过程。这是一个典型的两个实验室特色结合的例子。
7 n2 W' P9 |* SCombined Chemical Treatment Enables Oct4-Induced Reprogramming from Mouse Embryonic Fibroblasts: V! E, ^  w1 Z
XU YUAN,a HAIFENG WAN,b,c XIAOYANG ZHAO,b,c SAIYONG ZHU,a QI ZHOU,b SHENG DING STEM CELLS 2011;29:549–553* m3 X& x% B+ p) `
……Here, we reported identification of a new small molecule, a protein arginine methyltransferase inhibitor AMI-5, which enabled Oct4-induced reprogramming of mouse embryonic fibroblasts in combination with transforming growth factor (TGF)-b inhibitor A-83-01. The Oct4-induced iPSCs were shown similar to mouse embryonic stem cells with respect to typical pluripotency criteria. More importantly, they were shown to give rise to liveborn pups through tetraploid complementation assays, demonstrating the high quality of full reprogramming induced by this condition. Furthermore, this study suggests that regulation of protein arginine methylation might be involved in the reprogramming process.& r, q" O5 \# S! A- |6 s
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周琪实验室还在Cell Research上发表了一篇排除c-Myc的三因子诱导iPSC信函研究。三因子诱导小鼠胚胎成纤维细胞为iPS的效率大大降低，但仍能够用他们的四倍体补偿法生出小鼠。该研究的另一个结果是依据他们去年发表的imprinted genomic region Dlk1-Dio3 在四因子iPSC中的作用，进一步证实在三因子iPS中该位点的表达水平与iPSC的多潜能性呈正相关。某种意义上，这是去年发表的类似结果的三因子重复。胚胎成纤维来源，四倍体补偿法，特定位点，克隆是该实验室一系列结果的共同特点。5 l( _* T: x  p6 K6 j/ g$ j, W
iPS cells generated without c-Myc have active Dlk1-Dio3 region and are capable of producing full-term mice through tetraploid complementation. u# D4 M. m8 L/ M4 {; u, j0 w; N" p
Wei Li, Xiao-yang Zhao, Hai-feng Wan, Ying Zhang, Lei Liu, Zhuo Lv, Xiu-Jie Wang, Liu Wang and Qi Zhou Cell Res. 2011 Mar;21(3):550-3, {0 U9 D# y1 x, Z7 C$ ]" G6 l
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高绍荣实验室今年在Stem Cells上发表了两篇iPS相关研究。一篇是采用Oct4单因子首次将滋养层干细胞（trophoblast stem (TS) cells）重编程为iPSC，可以说是从另一个角度验证了滋养层干细胞的多潜能性。
; V0 ?' ^5 ^* c* I8 ~/ w+ lReprogramming of trophoblast stem cells into pluripotent stem cells by Oct4! ?% ~& P9 Y8 x9 @* w: n
Tong Wu1,2, Haitao Wang2, Jing He2, Lan Kang2, Yonghua Jiang2, Jinchao Liu2, Yu Zhang2, Zhaohui Kou2, Lijun Liu3, Xuehong Zhang3, Shaorong Gao/ g9 a3 {' y; I' P$ o  w, M/ w' q
……Here we report that overexpression of a single transcription factor, Oct4, in TS cells is sufficient to reprogram TS cells into a pluripotent state. These Oct4 induced pluripotent stem (OiPS) cells have the epigenetic characteristics of ES cells, including X chromosome reactivation, elevated H3K27 me3 modifications and hypomethylation of promoter regions in Oct4 and Nanog genes. Meanwhile, methylation of promoter region in the Elf5 gene occurred during reprogramming of TS cells. The gene expression profile of OiPS cells was very similar to ES cells. Moreover, OiPS cells can differentiate into the three germ layer cell types in vitro and in vivo. More importantly, chimeric mice with germline transmission could be efficiently produced from OiPS cells. Our results demonstrate that one single transcription factor, Oct4, could reprogram the non-embryonic TS cells into pluripotent stem cells.: q* O! A2 l* }

8 Z7 \0 x, a7 @高绍荣的另一篇研究是关于nuclear receptor corepressor家族的RCOP2在胚胎干细胞和诱导多潜能干细胞中的作用的。Knock-down Rcor2阻止胚胎干的增殖，减弱其多能性，并且妨碍iPS的诱导。而外源性表达则可以结合其他因子促进iPS诱导。同时该研究发现外源性表达Rcor2可以取代Sox2在诱导iPS中的作用。亚马纳卡经典四因子中，C-Myc已被证明不是必须的，Oct4和Klf4也已证明可以被 nuclear factors Nr5a2 and Esrrb所替代，Sox2可以被抑制TGF-b通路的小分子替代。高绍荣这个研究则表明Sox2可以由在胚胎干细胞增殖和多潜能性中具有重要作用的Rcor2所取代，对重编程机制的探索应该是一个进步。高绍荣去年发表不同发育阶段小鼠卵母细胞蛋白表达图谱研究，结合去年核移植技术获得iPS小鼠的工作，可以期待以后发现卵母细胞中可用于重编程的蛋白，那将是一个比较诱人的前景。高实验室去年还有一篇研究不完全重编程与胚胎畸胎瘤iPSCs之间关系的文章，挺有意思。实验室研究的发育学背景相对比较突出，有些东西与周琪实验室接近。
3 k; L6 h' w/ b  L/ U5 i! C1 @+ ORCOR2 is a Subunit of the LSD1 Complex that Regulates ES Cell Property and Substitutes for SOX2 in Reprogramming Somatic Cells to Pluripotency
% T$ d9 J8 h* }. gPeng Yang1,2,3, Yixuan Wang2,3, Jiayu Chen2, Hong Li2, Lan Kang2, Yu Zhang2, She Chen2, Bing Zhu2*, Shaorong Gao2*! \8 ?( [6 j8 {* v, b" x
……Here, we report that Rcor2 is predominantly expressed in ES cells and forms a complex with LSD1 and facilitates its nucleosomal demethylation activity. Knock-down of Rcor2 in ES cells inhibited ES cell proliferation and severely impaired the pluripotency.Moreover, knock-down of Rcor2 greatly impaired the formation of induced pluripotent stem (iPS) cells. In contrast, ectopic expression of Rcor2 in somatic cells together with Oct4, Sox2 and Klf4 promoted the formation of iPS cells. Most interestingly, ectopic expression of Rcor2 in both mouse and human somatic cells effectively substituted the requirement for exogenous Sox2 expression in somatic cell reprogramming.
( m( B6 P' u0 z- O1 i4 H7 m, B! Z- d: V$ ?/ L% O3 Z
邓宏魁今年在Cell Research上发表一篇研究，用四个小分子组合加Oct4的方法诱导iPSC。这四个小分子中的两个与表观遗传修饰（H3K4 demethylation and histone deacetylation）有关，另外两个与
5 l5 r. h& J/ n, @. x2 L; X信号转导通路（GSK3-β and TGF-β signaling）有关。因此，这里的逻辑推理是这四个小分子可以取代经典四因子中的Sox2，Klf4和C-Myc，考虑到这三个因子各自的生物学意义以及四个小分子的作用，可以说明这四个小分子是克服了上述四个iPS重编程的表观遗传和信号转导通路障碍。反过来也说明这些表观遗传机制和信号转导通路在重编程中的意义。这个思路是向着完全用小分子取代外源性因子诱导iPS。这应该是丁盛在做的事情。另外，该实验室延续胰岛细胞传统，在做iPS分化为胰岛细胞的工作。* ^/ t' W6 d& o
Generation of iPSCs from mouse fibroblasts with a single gene, Oct4, and small molecules
! `! i  ]% X( ~Yanqin Li1,*, Qiang Zhang1,2,*, Xiaolei Yin1,2, Weifeng Yang1,3, Yuanyuan Du1, Pingping Hou1, Jian Ge1,2, Chun Liu1,2, Weiqi Zhang1, Xu Zhang1,2, Yetao Wu1,2, Honggang Li1,2, Kang Liu1, Chen Wu1,2, Zhihua Song1,2, Yang Zhao1,3, Yan Shi2 and Hongkui Deng1,Cell Research (2011) 21:196-204.
. H5 I  n* \! T( T' g7 S……Here, we identify a specific chemical combination, which is sufficient to permit reprogramming from mouse embryonic and adult fibroblasts in the presence of a single transcription factor, Oct4, within 20 days, replacing Sox2, Klf4 and c-Myc. ……We also found that 8 days of Oct4 induction was sufficient to enable Oct4-induced reprogramming in the presence of the small molecules, which suggests that reprogramming was initiated within the first 8 days and was independent of continuous exogenous Oct4 expression. These discoveries will aid in the future generation of iPSCs without genetic modification, as well as elucidating the molecular mechanisms that underlie the reprogramming process.
: }) l8 _; M- {4 d% |$ |9 L' h$ l3 ^1 V- `! I1 ^. ?3 X
裴端卿今年也在Cell Research上发表一篇iPS相关研究，着眼于Klf4和MET（mesenchymal-to-epithelial transition）在重编程中的作用。该实验室去年iPS的研究与MET以及iPS过程的阶段性有关。这篇研究则试图解析不同因子在重编程过程中的相对作用，发现Klf4与初始阶段发动MET过程有关，这个作用可被BMPs所替代，但机制不同。同时通过分析Oct4/Sox2/Klf4不同结合模式的结果，来分析各自的作用，即在重编程中Klf4发动，Oct4起核心作用，Sox2起辅助作用。这个实验用的是该实验室建立的特定培养条件iCD1，包括VC，bFGF以及其他化学小分子。因此，结合上述结果的最终推论是，筛选可以取代外源性Oct4的小分子将可以提高重编程效率。这与前述丁盛和邓宏魁思路殊途同归。VC的作用，EMT是该实验室的两个特点，去年还有一片iPS疾病模型的尝试。2 f+ f% w& P4 L6 z: q# x
BMPs functionally replace Klf4 and support efficient reprogramming of mouse fibroblasts by Oct4 alone4 [8 Y  \9 k# u. u, z. ]/ Z+ z; \1 ?
Jiekai Chen1,*, Jing Liu1,*, Jiaqi Yang1, You Chen1, Jing Chen1, Su Ni1, Hong Song1, Lingwen Zeng1, Ke Ding1 and Duanqing Pei. Cell Research (2011) 21:205-2123 X7 Q2 v3 k' [1 V0 E. r7 f6 O
……Here, we show that Klf4 mainly acts at the initial phase of reprogramming to initiate mesenchymal-to-epithelial transition and can be functionally replaced by bone morphogenetic proteins (BMPs). BMPs boosted the efficiency of Oct4/Sox2-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to ~1%. BMPs also promoted single-factor Oct4-based reprogramming of MEFs and tail tibial fibroblasts. Our studies clarify the contribution of Klf4 in reprogramming and establish Oct4 as a singular setter of pluripotency in differentiated cells.0 D. P. c8 l! j

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这几个实验室关于iPS的研究各有特色，也都集成了各自实验室的传统。技术手段上的单因子（Oct4）、小分子、替代因子，机制上的表观遗传、信号转导、MET，过程和作用解析；效率与培养条件等，都属于目前iPS研究关注的主导方向。至于全基因谱系、表观遗传等方面的鉴定国内尚没见到，iPS分化靶细胞，疾病iPS系等，似乎还是个别例子。需要提及的是，在大家都因为是致癌因子而抛弃Myc时，亚马纳卡则看中其高效作用，用L-Myc替代C-Myc，似乎有解决成瘤性问题的苗头。将来在探讨这些经典因子，其他替代因素以及小分子的作用和效率、效益方面，大概还有很多可玩的。至于机制，iPS过程的细化比较容易些，而iPS重编程的分子机制，则应该有待于个体发育过程的分子水平以及胚胎干细胞多潜能完整机制的阐明。) N7 {0 O5 r& f, G" W. ~' Z
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看起来iPS作为一个相对比较新的研究领域，初始阶段方便捡拾的“红利”还有一些，但不大可能有什么重大突破了吧。发现一堆相关现象，以及一堆的问题和缺陷，离开人们热盼的应用，从某种意义上也可以说更“远”了。局部方向的研究之外，中国干细胞界在iPS上能走到哪里，或者说放在整个干细胞再生医学领域的大框架下看，这些相对力量集中的iPS研究把我国干细胞研究引向哪里。按说国家科技投入的直接目标是经济和社会效益，比如科技部长访问动物所看了iPS老鼠发表的讲话，强调的是转化和效益。而iPS起源的日本，则是在拼命搞分化应用。另一对iPSC的发明者Thomson和俞君英更是以商业公司模式与大制药商在搞疾病模型。加上一堆研究质疑声，iPS何去何从，值得思考。不过，从现实来说，这些实验室大概还会发表后续的结果，先看看能否有个形状吧。十二五干细胞重大项目里，设立了一些iPS相关的项目，包括直接转分化，包括应用。五年转瞬，拭目以待。
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3 W- Y1 j+ X: l' i7 o（理解有限，仅供参考。不负责任，勿要转贴）
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补充内容 (2011-4-1 08:25):4 _: X8 }& e8 S' [
一篇裴端卿实验室最新研究见十一楼。

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5 X" V% Z" s8 a4 x
& S! X, a: `+ l: k& H
* Y  C6 T0 j! n  z1 g( A$ P. C3 R. o- p- N+ K8 q$ X
有几篇文章是文献互助网友提供，致谢。

tpwang

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9 h$ O" D/ ]- u/ K3 M7 R0 X" x$ O$ |, i
' o' O. C) A! vNo declaration of conflict of interest.:)

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/ v, j$ c' P& Q/ k. o裴端卿实验室的一篇新文章。  H/ f. l) n) s3 f8 |; \8 P) W. b7 ~* x
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关于iPS重编程培养条件的。前面的研究已经采用了这个模式，这次发表的是一个相对完整的逻辑推理为基础的优化过程，所谓rational optimization。筛选有效因子library，建立基础medium，然后把各种因子在medium里加以screen，优化最终因子的浓度等，然后以这个诱导条件（iCD1）组合三个经典外源因子，鉴别各自的可能作用。然后得出一个OCT4+iCD1的方案。
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方案标准化，高效率、有很好的机制为基础，覆盖不同角度的成果，这是所有iPSC方法最终要胜出的必由之路。该实验室这个思路在这方面挺有创意。5 y: Y$ e: z% p6 c' D

4 ~/ E# ]& A  v$ U1 A这个思路更像是工艺化而非proof of principle，虽然其中还有机制的提示。这是个小鼠研究，估计下一篇是人的iPS结果。然后申报专利，推出标准，拿出产品原型，便可以考虑产业化了。拭目以待。
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这是个非常好的问题。从培养条件寻找iPSC的重编程方法，将会引向核移植的根本问题，即卵子环境如何影响和核移植的重编程。前文里说到高绍荣去年发表一篇不同发育阶段小鼠卵母细胞蛋白表达图谱研究，该实验室去年也采用核移植技术获得iPS小鼠，如果从卵母细胞中可找出导致重编程的蛋白，那么就有可能从中导出体外诱导重编程的新方法。从培养条件入手寻找重编程方法好比是从另一端往中间走，最后有可能将核移植和体外诱导衔接起来。不仅找出重编程的终极方法，而且会接近搞清楚重编程的机制。从这个角度，iPS大概可以看作是从核移植演化来的一种中间技术，不是一个独立产品，最终是走向完整理解和复制重编程的一个阶段。两头的研究贯通之时，就是重编程机制完整揭示之时，对发育的理解也会意义重大，还可能会影响体内重编程的探索。干细胞的终极前景就比较明朗了。9 r8 B1 ^6 ]/ m0 B
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天下的事，都是“远曰返”的规律，所谓画圈圈，不过是螺旋式的往上画，而不是原地平面画圈。这是很常态的，但这个过程会是很有趣的。) X3 g0 Q/ H; r* y( g* _/ Y* n

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" z! g( Y0 X* ?" X/ g, l" o' W, \裴端卿实验室新发表一篇miRNA诱导iPSC的文章，还是挺赶时尚的。Cell Stem Cell最近有一篇类似的文章。这个途径以及相关配套手段、机制以及效率，引起不少争议。mRNA，蛋白方法至今也还没有见有重复。重编程机制本身没有个明晰的框架，可能导致重编程现象的手段除了经典外源性OSKM外，其他方法都不够robust，手段与机制之间，来回倒，有点“双盲”的味道。这些新手段的实际操作问题是“准入门槛”越来越高，无法得到足够的及时验证与推进。# S/ i( ~" J0 C# K6 \' i2 `

, H$ i, e' o* ~/ L/ `5 x从理论的角度出发，找出单一手段自然很吸引人，而从实用角度，可能寻求高效多因素方法更可行。现已有结果的，除经典OSKM外，蛋白、小分子、mRNA、miRNA等，单独作用或组合作用都还没有建立一个reliable and valid模式，加上效率问题、病毒载体、潜能效果、基因与表观遗传后果等因素，以及细胞来源和培养条件，以及一些附加的手段，iPSC看似新闻不断，应该说还远没有脱离各层面上概念证明的初级阶段。下一步的路怎么走，不能指望不断出现一些新概念的证明，而要不断有系统的整理、比较和优化阶段。
: I- S6 T' G# ?' I% H6 q# |# D/ W. X! b" S9 h  k2 M: u. L
看来，对手段与机制要求不高的疾病模型是更接近实用的方向，但要有效模拟复杂疾病及其病理，也不是容易的事情。
, h& ?$ _* h* T' C+ ?# J
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