干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站
标题:
骨髓干细胞就鉴定 有图
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作者:
骨道边
时间:
2011-6-1 18:42
标题:
骨髓干细胞就鉴定 有图
[attach]27893[/attach][attach]27892[/attach]软骨出来了,可是骨髓基质干细胞长的还不行,现在我都不知道是不是干细胞了。让我一个做成骨细胞的师姐看了一下她说是成骨,让做软骨的师兄看他说是软骨。搞得我都很晕了。希望大侠们指点。现在简单把我的整个过程跟大家说一遍,有什么不足的请指正。
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1.取160-180g的SD大鼠一只,用3%戊巴比妥钠1.5ml(致死量)麻醉,拨皮,手术器械取下整个下肢,需要软骨的话注意不要把股骨头关节面破坏了。75%酒精泡15分钟移入超净台。
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2。用pbs漂洗两遍以上,在一次性培养皿中剃掉多余的软组织,剃的越干净越好。
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3,移入另一个培养皿,倒上点pbs,用手术刀削下股骨头上的软骨,注意不要削到软骨下骨,还有把半月板也取下来,剪碎。收集到离心管中胰蛋白酶37度摇床中消化10分钟后弃上清,加入二型胶原酶在培养箱中消化,分别于24h和48h分两批收集软骨细胞。(如果补需要软骨的战友们可不用这一步)
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4,用止血钳固定已经分离好的股骨和胫骨,用咬骨钳要掉两端。此时需要一个新的培养皿加入新鲜的α-MEM10ml左右,用10ml的注射器吸取培养液来冲洗骨髓到培养皿中,反复冲洗3次以上,剩下的骨头都这样处理,冲下来后在用吸管来充分吹打匀悬浮细胞。
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5,将混悬液移入培养瓶中放到培养箱中培养
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6,前三天不去看它,也不要过多的打开培养箱
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7,第四天给予办换量换液
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8,第五天全换量换液,并用pbs冲洗两遍,如果瓶底发现杂质较多可用吸管在瓶内吹打瓶底的杂质
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9,接下来就是换液,看细胞的生长状态
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以上就是我的整个实验步骤,结果是我的细胞是长出来点了,可是瓶底的杂质较多,所以我每次换液的时候都要把pbs灌满培养瓶用吸管吹打瓶底,只要是贴住的细胞不会被吹下来的这可以放心,如果挂到就不敢保证了。可是那些杂质和细胞碎片很难被吹下来。所以我的细胞没有长成一大片而是散在的小团伙。
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我是5月20号做的,到今天拍的片子,请大家看看给我鉴定一下是不是干细胞,下一步该怎么办,是传代还是直接传到六孔板中爬片鉴定啊。
作者:
骨道边
时间:
2011-6-1 18:48
[attach]27897[/attach][attach]27896[/attach][attach]27895[/attach][attach]27894[/attach]
作者:
骨道边
时间:
2011-6-1 18:49
大图为40倍镜下,小的为20倍镜下
作者:
骨道边
时间:
2011-6-1 18:55
[attach]27899[/attach][attach]27898[/attach]
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补充内容 (2011-6-1 18:57):
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请大家不要责怪,第一次用上图请原谅。拍图也是第一次拍,这两张也是20倍镜下图片。
作者:
皮搋子
时间:
2011-6-1 19:06
8,第五天全换量换液,并用pbs冲洗两遍,如果瓶底发现杂质较多可用吸管在瓶内吹打瓶底的杂质&
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这步貌似有问题吧,你说的杂质是什么?
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作者:
tangyvhuang
时间:
2011-6-1 19:18
有点像间充质干细胞,这密度还是养几天看看吧。步骤没什么问题,我觉得直接爬片鉴定吧,有时候形态不说明问题,也许你看着不像的细胞他就是呢。诱导一下呗
作者:
文武庙
时间:
2011-6-1 19:30
个人也觉得仅凭形态难说明哪种细胞,如果能测表型神马的,还是上个流式啥滴比较好!
作者:
wenfeng8212
时间:
2011-6-1 19:54
我觉得应该先纯化一下间充质干细胞吧。用4倍看一下细胞密度,细胞密度到80%左右,就传代。
作者:
骨道边
时间:
2011-6-1 21:46
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皮搋子
的帖子
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因为全换液量的时候好多细胞,本人觉的是血细胞吧,它也不长,冲也冲不掉,就是圆圆的。冲掉的那些细胞就留下了小点点。那些就是杂质吧
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作者:
骨道边
时间:
2011-6-1 21:49
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tangyvhuang
的帖子
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我做的是先把干细胞养出来再诱导成软骨,所以如果它不是干细胞的话就诱导不出来了。那先养一养吧。等它长多了传一传代,留点本钱,第一次养出来。呵呵。。。谢了,以后向你请教哦
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作者:
骨道边
时间:
2011-6-1 21:52
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wenfeng8212
的帖子
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好的,也是这么考虑的,就怕它长不到那么多,有些细胞师姐说状态不怎么好了,伸展的不是那么大,开始有点回缩了。回缩了是说明这细胞的活力差了吧,只能再养养看了。谢谢了,请多指教
作者:
骨道边
时间:
2011-6-1 21:55
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文武庙
的帖子
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可是我这一瓶就够做这么一次,传代会不会让细胞纯化一点啊。今天怎么听到我师姐说越传细胞越不纯,真有此现象吗
作者:
taxuewuge
时间:
2011-6-1 22:55
上图是原代的图吗?我做的原代数量比你的多,基本上贴满培养瓶的80%才传代的,我做原代用的是全骨髓离心法,得到的细胞相对纯,而且我是把鼠的肱骨和股骨的骨髓全用D-Hank's液冲出来的,所以离心后得到的细胞数量较多。如果上图是原代的话,我觉得细胞量太少了,传代可能会导致密度太小,细胞长不起来,建议在培养一段时间。注意细胞都有一定的生长周期,时间长了,细胞就会衰老,所以一定要注意观察细胞的形态。如果培养后不行的话,就重做吧。
作者:
骨道边
时间:
2011-6-2 12:52
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taxuewuge
的帖子
! Q' R' C0 K1 j, K) R
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好的,我做的就是原代的,步骤就是我说的那样,没有离心。再看看,不行那就重做了。我这次的问题是不是第一次换液的时间间隔有点长也有关系啊?两天就第一换液的话是不是就可以吧那些不贴壁的细胞冲的干净点,瓶底也干净点细胞好长?谢谢指导
作者:
taxuewuge
时间:
2011-6-2 18:04
我取原代是用离心法,得到的细胞相对较纯。所以分离后第三天就进行半换液。如果细胞5天还不贴壁的话基本上以后也贴不了。第二天就把不贴壁的细胞冲干净,就会让一些贴壁较慢的细胞无法贴壁,那样瓶子里贴壁的细胞太少,达不到一定的密度,细胞就会长不起来,而且传代以后细胞的量就更少,根本无法长满瓶底。我养细胞才一个月,以上只是我的拙见,仅供参考,有不对的地方请多多指教。
作者:
临床干细胞
时间:
2011-6-2 19:15
我觉得挺像,应该是干细胞没问题
作者:
ytumuyangren
时间:
2011-6-2 23:40
看着形态和我刚开始养的软骨有些像,刚开始我同学以为是纤维细胞呢,但是老板说软骨细胞没长起来之前也会是长梭形的,因为他们都是来自中胚层的分化。所以不能单纯的就形态说明是什么细胞,养养看吧,祝你好运。呵呵!
作者:
骨道边
时间:
2011-6-3 15:34
好的,希望它能长起来了,今天以看1号传代的软骨细胞长的真是疯狂啊,都长满了,我赶紧给冻存了,可是今天师姐感冒了不来科里,老板这两天都不在,不知道又上哪里旅游去了,只能自己来了。你冻存过么?有什么注意的地方跟小弟我说一下啊。谢了
作者:
liuerfu
时间:
2011-6-3 23:06
我做的是先把干细胞养出来再诱导成软骨
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你可以用鉴定软骨的方法鉴定一下,看是不是软骨细胞
作者:
liuerfu
时间:
2011-6-3 23:09
我看别人提的干细胞也只是形态上大致管擦一下,只是在细胞确实长得像msc时才用流式细胞仪检测。
作者:
骨道边
时间:
2011-6-4 20:18
那你那里有干细胞的形态的图片吗,我也不知道什么时候才长得确实像干细胞啊,呵呵
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