还是关于PCR

Learner

我订购的合成引物上面给了两个Tm温度，一个是Tm(1M Na+)的温度是78.1度，一个是Tm（50mM Na+)的温度是56.5度。我不知道那个对我更有参考价值。以前跑的PCR都是现成的引物，定好的循环程序。现在深究起来这中间其实有很多东西自己都是似懂非懂。过一阵可能我还要做实时定量PCR，想问一下关于引物序列除了有荧光标记外与普通的PCR的引物序列有差别吗？希望这方面的专家不吝啬赐教。谢谢！

hndxws

了解什么叫Tm值对你理解PCR和选择条件有帮助。

like_gj

Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。
' R; }. o8 n5 S$ A+ [9 j在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。 7 N. _5 A: U% e- _
我是习惯性选低的那个减5度 但也不一定都很好
/ W# i& [" x) }. j% X  `1 C& E# d现在的PCR仪都有梯度的功能 做个梯度不就OK了

johnnymmzhrt

你设计的退火温度一般比Tm值低5度就行，Tm可以选那个低一点的（高的Tm值似乎是在特殊的缓冲条件下测定的）。不过根据你所用的引物种类不一样退火温度也是需要调整的，如果有梯度PCR仪是最好了，没有就需要Tm-5左右试试看，说不定还要做touchdown才能成功，多试试看吧  祝你好运~

hcluo

Na离子浓度不同，产生的Tm不同，说明了在配PCR反应体系的时候，里面的离子会有一定的影响，这是需要注意的地方。另外，据我说知，Tm(1M Na+)的温度指的好像是southern杂交是需要考虑的温度，而Tm（50mM Na+)的温度是PCR需要考虑的温度。当然，在做PCR之前，都需要做个预反应实验，测试一下哪个温度更适合自己的体系。

xuyq706

不同的软件对Tm值的计算方法不一样，一般Tm（50mM Na+)的温度低3-5度是PCR反应的温度。实时定量PCR需要设计引物时考虑产物的长度在80-150bp为宜，正向反向引物Tm相差不超过2度。