大家有没有好的方法可以分离有活性的特异性CTL的单克隆

wagumaxida

之前试过软琼脂，这玩意不是病毒，不行 大家有没有好的方法可以把有杀伤活性的特异性CTL给分离并克隆出来，卡在这里快一个月了

pipi168

试试vic培养基

cochongg

能说具体一点吗

wagumaxida

pipi168 发表于 2012-5-6 10:53 , g/ a9 ]) E. G5 O
试试vic培养基

4 k& v$ r2 ]8 X3 _. v这个是什么培养基？ 有资料吗？

wagumaxida

cochongg 发表于 2012-5-6 11:16   w4 E# i1 t: F" m% p! N
能说具体一点吗

0 g, c7 X4 z0 _
恩 就是我用抗原（总RNA）负载了DC，接着用这群非特异性DC来诱导T细胞成为特异性CTLs，然后我就想把其中特异性的CTLs分离出来

xinquan15

关注中

漫步云端0511

MHC-肽多聚体方法试试

312473313

我之前摘抄的一篇文献的负载抗原诱导CTL的培养方法，仅供参考3 T0 ], B/ B- ], m
1、分离脐血单个核细胞1 |3 a. d4 p( N' I* m' G3 [; I
采集脐血进行单个核细胞MNC分离，将标本与6%羟乙基粉以4：1混匀后静置30-45min，取上层橙黄色液体，用Ficoll-hyPague分离液（比重1.077）密度梯度离心法分离MNCs，用PBS洗涤2次，调细胞浓度为5*106/ml于37℃、5%CO2培养箱孵育2h，分离贴壁细胞和非贴壁细胞。# k" v+ g/ i) F& z
2、负载细胞冻融抗原DCs细胞的培养。
, u+ N# H6 u; d7 t" i& r* Q贴壁细胞用含10%FCS的完全培养液，加入细胞因子GM-CSF100ng/ml和IL-4 20ng/ml,隔天半量换液继续加细胞因子GM-CSF100ng/ml和IL-4 20ng/ml，第4天加入细胞冻融液0.5ml（细胞密度5.0*107个/ml），第6天增加细胞因子TNF-a 20ng/ml和PGE2 1ug/ml，诱导DC成熟。第7天收集非贴壁细胞。: m' l$ N, H' }% U3 e
3、DCs诱导CTLs产生
) T7 m) R0 `: N8 ?% [% A% O分离单个细胞经2h贴壁后，取悬浮细胞，调细胞浓度为2*106个/ml，用含10%FCS的完全培养液加入细胞因子 抗CD3单抗（500ng/ml）+IL-2(200U/ml)培养；每3天补充IL-2（200U/ml）1次，待到DCs成熟后（第7天），培养的细胞与DCs按照10:1的比例混合，用含10%FCS的CM培养，加入IL-2（200U/ml），作用72h后收集细胞计数。( b/ R4 F4 a$ E5 @+ q