人ES细胞用悬滴法形成EB，形成的EB状态老是不好~~~

ielisa

培养的人ES细胞，传代时收集细胞，做成悬滴，30微升每滴，在培养皿盖内表面悬滴培养两天后再悬浮培养，已经做过两次了，可是形成的EB状态一直都不好~~就可以说完全没有形成EB，克隆松散，形状不规则，并且颜色也是灰色那种，根本不是亮黑色~这是怎么回事啊？我做的悬滴太小？悬滴的48小时内部营养已经消耗殆尽了？还是我做悬滴时把细胞打的太散了？抑或是细胞状态本身的问题？求各位大侠给指点迷津一下啊！！！！实在是很着急啊！！！哪位大侠有ES形成EB比较好的protocol能否共享下啊？实在是非常感谢了！

sdjnkx

胶原酶的浓度，或者消化时间

BDFCM

回复 ielisa 的帖子' X2 A5 \' u( M6 I% p0 L
3 W9 E4 Y- F" C* O  k3 G' `
人胚胎干细胞单细胞悬滴法是不可行的，小鼠的ES用悬滴法是比较合适的。
* _& `+ F: ]! t7 E! f7 G人的ES通常是类似传代的消化，只是划线之后，把clusters转到低贴附的培养板里，悬浮培养形成EB。
2 W. J, ]3 J0 P8 f你可以试试

ielisa

回复 小禾禾 的帖子# D1 z3 S/ a* z1 o8 C: X* v# f

* t0 d( d* t* k! H% h7 oIV，恩，好，我下次试验一定注意下

小禾禾

回复 ielisa 的帖子2 g4 S! E4 X% L

; T' m+ p. c+ p/ v0 r8 {4 h, c6 v  D胶原酶几？然后消化时间太长了。。几分钟就可以了。一般小鼠ES采用悬滴，而人的不是

ielisa

回复 细胞-77 的帖子/ v: O- z1 }0 B( O- m( {# y. N

. B% I  J/ E3 _7 @1 U3 V这次的没拍照，形成的EB要么就是很小很散，要么就是完全散掉了，没有成行，请问你有好的protocol没有？或者操作过程应该注意哪些细节呢？

ielisa

回复 小禾禾 的帖子
- Y$ ~7 z; b5 E* r9 j
8 u0 ]0 @: S# Z6 z胶原酶消化大概45min，我们实验室倒是有那种培养皿，我是看文献说悬滴法形成EB质量好，效率高才用悬滴法的，下次我试试不用悬滴法吧

sunny1987324

我也遇到相同的问题，只不过我培养的是小鼠的ES.希望高人指点。

细胞-77

有图吗？能否上传几张图来看看，图才能够直观的反应你的问题。可能是你的操作中的细节没有注意好吧。
$ ?$ k: I% H% N. e

小禾禾

回复 ielisa 的帖子  Z5 B  a, k. _" v
+ |( y; ?' {) U2 K4 I5 |! b3 T: Z
你使用什么酶消化的？消化时间是多少？做人ES的EB，一般不用悬滴法，常采用低吸附的培养皿悬浮培养即可。