细胞复苏为什么遵循慢冻快融原则？

happy_noel

细胞复苏为什么遵循慢冻快融原则？如果慢冻不会出现冰晶，那慢融为什么会出现冰晶？最近细胞复苏活率很低，始终不知道是什么原因，冻存和复苏都使用同样的手法，有的细胞批次就正常，有的就会死亡很多。大家冻存都用液氮架吧，拿一个冻存细胞需要把整个架子提出来，其它细胞经过反复冻融是不是也是影响活率的原因？怎样避免其它不相关批次细胞反复冻融？大家可以一起探讨，谢谢！

LIW

同问

Andyhigh

发边下自己的看法：1. 细胞冻存的时候，有冷冻保护剂如DMSO，能对细胞起到保护作用，还有冻存盒里面的异丙醇能起到程序降温的作用。而解冻的时候什么也没有，并且只有温度降低的时候才会接冰，温度快速上升，不会接冰的。反复冻存一定会有影响的，尽可能减少细胞在不正常温度下的时间是最简单有效的办法，如解冻时找人帮忙，合理的安排使用液氮，包括位置和冻存细胞的分类

Andyhigh

发边下自己的看法：1. 细胞冻存的时候，有冷冻保护剂如DMSO，能对细胞起到保护作用，还有冻存盒里面的异丙醇能起到程序降温的作用。而解冻的时候什么也没有，并且只有温度降低的时候才会接冰，温度快速上升，不会接冰的。反复冻存一定会有影响的，尽可能减少细胞在不正常温度下的时间是最简单有效的办法，如解冻时找人帮忙，合理的安排使用液氮，包括位置和冻存细胞的分类

jensn

楼上的回答基本说明了问题，不过我想从另外一个角度试着来说两句：从液态到固态是个吸能过程，从此时细胞管内体系来说，是从外界引入了自由能的混乱度，而使本身的自由能下降的过程，从一个体系来说，天然有维持自由能的平衡的要求，因此，慢冻可以使体系自由能的增加缓慢，利于体系的稳态。而固态到液态的过程，对细胞体系来说是释能的过程，是使体系混乱度增加的过程，这是能势上的自发反应，应该越快越好，所以要快融。

Andyhigh

回复 jensn 的帖子' `, v$ D; C1 x- t5 R$ ?$ ~/ h
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楼上的回答很新颖，不过有点难理解，其中“天然有维持自由能的平衡的要求”  是指  “体系自身具有维持本身自由能不变的意思嘛？”  化学没学好···

bloodroses

分享一下我冻存细胞的方法，抛砖引玉。3 Q3 d8 P+ ]( f/ Q
冻存时，用50%FBS，10%DMSO的冻存液；把冻存管用纱布和棉花裹严实，再放进泡沫箱里，盖好盖，细胞连同泡沫箱一起放﹣80℃冰箱过夜（这么做纯属偷懒），然后再放到液氮里。
  B7 c( u. V2 C/ V) L0 F% {6 U复苏时，把冻存管放入39~40℃的水里（水尽量多一些，我是在1000ml烧杯里装500+的水），用镊子夹住，完全浸没（冻存管用医药胶布缠住，水不会进到螺口里的），不停的摇动，快速溶解。
5 n6 y# |4 Q  g2 v) r2 w' Y: ^' ^把原始种子批放到液氮罐的最下层，需要经常取的细胞放到上层，取的时候迅速一些，就能避免反复冻融了。, w$ e( y3 ^* j
我处理的是小鼠成纤维细胞，也许比较禁折腾吧，我的操作比较不合规范，但是细胞活率还挺满意的。

184lj

冷冻时DMSO作为冷冻保护剂，渗透入细胞需要一定的时间；而DMSO在常温下有一定毒性，因此复苏时应该， 尽快让其与细胞分离。

jiangyinshen

jensn 发表于 2012-11-27 09:22 . C4 ^' o6 M4 {2 k. z6 Q1 \
楼上的回答基本说明了问题，不过我想从另外一个角度试着来说两句：从液态到固态是个吸能过程，从此时细胞管 ...

& t. ]: Z0 m' P( Y' Z! u
阁下是不是学过物理化学，对自由能和熵变了如指掌啊

huayuecell

3楼5楼都回答的很棒2 z  A8 i+ ?4 B7 R; p. T9 Z
我来说下楼主谈到的另外几点：冻存和复苏是一定会对细胞造成损伤的，各种冻存的方法只是尽可能降低这种损害，冻存过程中如DMSO、降温曲线的设置都是为了使细胞内部的水分不生成大的冰晶，而不是不形成冰晶。
# t6 f# U0 g% a5 V+ E7 Z7 @而不同批次的细胞冻存效果不可控是完全正常的，首先冻存前的细胞活率不同，其次用液氮冻存盒不能保证降温曲线的可重复性。如果要保证良好重复性，那只能是配置程序降温仪这类仪器。
9 S3 y3 s& a( z# \, I. f& T如果担心整个冻存架带出太多样品，可以考虑给你们实验室的液氮罐配置冻存条。