论坛提问回答集锦

tonkanl

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最近打算养CIK细胞，看了论坛内免疫细胞治疗专区的很多帖子，获益不少，特别是一些帖子的提问和回答获益匪浅，把这些整理了一下，希望对各位特别是新手有一点帮助。
* Y0 U# e. }" s* @9 g+ }还不会发附件。只好粘贴在后面了。
4 p/ B' x1 h( o问1：3 J; J/ a# g2 w" \8 V
如果血液是加了抗凝剂的，那么离心获取的不是血清，而是血浆了。血清，指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。血浆是离开血管的全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，所获得的不含细胞成分的液体，其中含有纤维蛋白原（纤维蛋白原能转换成纤维蛋白，具有凝血作用），若向血浆中加入钙离子，血浆会发生再凝固，因此血浆中不含游离的钙离子。+ B' E$ Z2 G; M- [+ }
血浆如果不经过处理，去除纤维蛋白原，那么在加入到培养基之后会发生凝固，培养基会变成凝胶状（本人遇到过），因为培养基里有钙离子。抗凝剂如果是用枸橼酸钠，那么血浆中的枸橼酸钠一般是超标的，加入到培养基之后，还会结合培养基之中的钙离子，造成培养基之中钙离子浓度减少，进而影响细胞生长。所以得注意额！
+ y4 m, M# Q" ?0 x3 G5 T% l' d3 v问：你的回复解决了一直困扰我的问题，太感谢了，还有一个问题想请教，培养CIK 不加血清生长很慢，当时血清量很少，不够用，有没有什么好的办法或者用什么培养基，来克服这个问题，让细胞稳定生长，再一个问题就是怎么去掉血浆中的纤维蛋白原呢？因为取全血的时候一定要加抗凝剂的。
8 T0 N/ z+ G! n0 X# q0 {* H% b$ ~/ u答：首先，培养基可以选用无血清培养基，国内外很多公司有很多种无血清培养基供你选择，在无血清培养基里加入一点血清更好。其次，取全血时所用抗凝剂最好是肝素钠，好像商品化的采血袋里都不是肝素钠，这需要你们自己制备肝素钠采血瓶或采血袋，获取的血浆冻存，然后室温解冻，纤维蛋白原就会析出凝固，用吸管吸掉凝固物，再高速离心下就OK了，能再过滤一下就更好，细胞培养的用途下血浆不宜加氯化钙去除纤维蛋白原，因为量不太好把握，一般会加足量氯化钙，那么在血浆加入到培养基之后培养基之中就增加了钙离子浓度和氯离子浓度，影响细胞生长。
' N( \1 J( V# Q- k问2：takara培养袋培养CIK细胞，最大装多少合适？takara GT-T610的细胞培养袋，再培养CIK细胞时，最大体积是装多少合适呢？袋子说明书上标示的容积是200ml-1800ml，是全部装满1800ml也可以呢？还是太多会影响细胞生长呢？烦请各位前辈解疑！
9 V* t. ]" {3 f3 N* |5 j答1：最大体积你控制在1500ml，最少不能少于180ml，如果初始体积太少会影响细胞生长，细胞不容易长起来。体积超过1500ml，整个袋子会非常鼓，拿放的时候不太容易，也很容易让袋子划破。细胞长得好不好，关键还是初始密度，一般在2X106/ML, 密度太低不容易增殖。终体积不要超过1800ml，一般最大也就灌倒1500ml。1 z7 F5 I$ ~1 i4 _
答2：少于400时不要用袋子培养。。现在培养瓶中培养然后再转袋。  这个袋子一般装到1.8L( ]. z( Z( |) l  W0 P
答3：培养液较少时200-500mL，可以将培养袋折叠到一半的面积放置。1.8L最好不要超过1.8L，超过了细胞袋比较的鼓，四个角开始上翘，达不到最佳的培养效果！
$ S' p  I- J0 E7 ?! k7 L- t问3：CIK细胞的回输问题。每次回输的CIK要达到9次方，这么大的细胞量，悬浮到250毫升的盐水里面很容易聚集，做过实验，用羟乙基淀粉，血浆，不同的比例都试验过，放置半小时，都会有细胞聚集，应该怎么样防止细胞聚集呢，请大家发表意见，呵呵
* w3 \( h4 z: d答1：我们这边做的CIK，每次回输细胞数量也是达到10^9的啊，短时间内细胞悬浮得还不错啊，我们一般会在盐水里加人血白蛋白，浓度为1%。, [+ X9 t7 x, m+ F$ J- Y" T
答2：我们回输都有10的10次方，用200ml生理盐水加5ml人血白蛋白，细胞收集的时候要混均匀，有的时候出现聚集也正常。回输的时候用输血的输液管（带滤网）就OK了。
& a. L) X" [$ C, j/ a答3：每次回输细胞（80-100亿）用200ml生理盐水稀释并加入2.5克人血白蛋白（20%的制剂），这时的白蛋白起到稳定剂的作用。'回输时需要用一次性输血器（带滤网）。一般很少出现絮状物，如果出现絮状物且摇不散的话，很有可能有真菌或支原体污染。# d, h# |1 k9 y2 T
问4：用的自体外周血単采培养CIK，采集后发现脂血严重，培养后观察脂肪细胞很多，请问对CIK的培养有影响吗？如何处理，谢谢。追问：是肿瘤化疗前，病人家属想给病人大补，吃了几天高蛋白食物，用单采机采的外周血，严重脂血，洗了三遍，还是没有洗干净，根本无法分离，加培养基以后，培养基直接变混，近似黄色，根本无法培养
6 F4 \$ T" z( f  ?" m+ S答1：这位兄弟，外周血哪儿来那么多脂肪细胞？甘油三酯吧？单采后如果油脂过高，还是需要用淋巴细胞分离液处理，再离心会好一点。采血前有规定啊，不宜高脂餐，化疗前要大补也等采血后再进行，一定是没给临床解释清楚。（是由于临床没有给解释清楚了，导致采血出现脂血，用淋巴细胞分离液分离了，用盐水也洗涤2次了，没有用，无法分离啊，呵呵，下次一定注意临床采血前的饮食指导工作，在采血前应把整个治疗流程，包括化疗，放疗的流程安排妥当，以前一直是培养DC的，CIK的肿瘤治疗刚开始，临床上，培养上还需要一个适应过程吧，希望大家多提宝贵经验，谢谢）
" S* L) ]9 L! C问5：培养CIK用的培养液。不知道各位培养cik用什么培养液好啊，哪些长的快呢，是否加血清？我现在培养的前期还长的挺快，等转到袋子里就很慢了，几乎不长了，对于后期生产慢需要怎么改进一下，大家都培养多少天啊！
( I" H# |% E: u% n8 \" Z% d答1：宝日医的就可以啊，这个价格比较便宜些，其他的像Lonza的培养的效果更好，就是价格贵些。细胞分离的时候把分离的血清同时加入到培养瓶中会对细胞扩增起到一定的促进作用. z: i& H1 p1 W" X: I% ~
答2：我用宝日医的长的可以，培养时可以加一点自体血浆增殖会好点，一般培养半个月
$ n, l! T) M" c5 Q( E' h答3：我们用的是X-vivo 15，就是有点贵！我们推荐你们用一下GT-T551，培养前期1-8天加上2%-5%的自体血浆，细胞长得比较好。还要注意自体血清较少，做好用自体血浆。制备方法就是采血袋采回来血液后，将血液分装至50mL离心管中3000转，离心10分钟左右；取上清移入新的离心管中，56°C水浴灭活30min，然后4°C冰箱中泠凝半小时；3000转离心15-30min取上清可得自体血浆！！+ Z2 U' X: e4 S9 z5 ^& ^
答4：我们用的GT-T551，价格便宜增殖效果还好。如果是科研用，可以用1640+NCS10%即可；如果临床用，建议使用GT-T551.前期培养可以加自体血浆，自体血浆必须灭火离心之后才能使用。另外，细胞因子也很关键。4 N) c6 k: g5 O* c  ^& E* |
问6：关于CIK加因子的问题。我们这里做CIK都是day0加IFN-γ，day1加CD3和IL-2.不知有没有同学加过IL-1和IL-6或者其他因子的。效果好吗，有什么作用，希望大家讨论一下$ ~7 i0 h' t& X% ~7 h1 z
答1：我们是加了IL-1α，主要是为了激活淋巴细胞。（转自干细胞之家）但是确实有文章中提到在培养中IL-1的作用比较小，加与不加结果差别不是特别大。" B2 r4 @7 l7 O, v- D5 Z
问7：请教关于脐血CIK细胞增殖团与CD3，CD56双阳性的问题。小弟刚刚接触CIK，养外周血CIK时，增殖团的数量和体积都相应增加，第7天双阳率是10%，第14天到了50%。!:诱导方案是INF-γ 1000u/ml, 24小时后加CD3 50ng/ml，IL-2  300U/ml，之后2~3天半量换液，补充IL-2到300U/ml。培养基用国产无血清培养基。分离液是Ficoll 1.077。可是养脐血CIK时，分离方法和诱导方案以及培养基都相同。~第3天的时候，可见少量增殖团生成，到第7天检测时，双阳率在0.5%以下，之后培养基又用PRMI 1640+10%FBS，以及在培养基中加10%自体血浆。重复4次试验，都是只见增殖团，流式检测时，双阳率都在1%以下。恳请高手帮忙分析一下原因啊，谢谢。+ g: I! ?3 e  G0 n: M
答1：你在养外周血的时候，也加入FBS了吗？应该是自体血浆吧，你试一下10%FBS和10%自体血浆只加一种，因为自体血浆超过10%是对细胞有毒性作用的- W" s: Z0 \5 k1 e, v
答2：做了一段时间CIK个人我这面的培养体系和你的差不多  IL-2是500的   而且我做的都是癌症病人的血，少部分脐带血，个人感觉脐带血增值效果会比病人外周血好太多了，你的外周血是正常人的吧？个人感觉外周血体系用在脐血上问题不大, K) L; i+ E2 q! L! ?
问8：DC CIK的临床应用问题。我们这里CIK的收获是100ml生理盐水重悬，加入1%的人血白蛋白，取流式，计数，还有内毒素的检测。:不知还有什么更好的收获方式？一般还要做哪些质检，还有就是收获后的细胞要怎么保存，多长时间内回输？希望大家赐教！
% f" |1 Z. N( A* d/ U6 b答1：收获方式都是离心管收集吧。。。 质检要做细菌、真菌、支原体和内毒素， 看细胞质量要做流式检查。。  收获后尽快回输。。一般1-2小时内吧。 保存在4度？ 目前我们都是收集后立即回输
% L: o$ D; t3 E; `& T5 G" V答2：做检测也就是在分离细胞接种前取样检测，中间细胞长得很快，中间可以肉眼和镜检相结合的办法观察，很容易辨别有没有污染，到回输时，再取样检测，结果的意义无非就是检测操作人的操作有没有问题，如果有问题就承担责任，当然这个检测结果要几天之后才出来，回输的细胞早到病人体内了0 X* E0 ~+ P) c  U- U- h
答3：CIK细胞质检包括：细菌、内毒素、存活率、杀伤实验、流式。每一种检测有相应检测时间，细菌、真菌回输48小时和当天，流式、杀伤实验在准回输头一天检测目标细胞的含量和杀伤肿瘤细胞的能力，内毒素、存活率当天检测。另外回输当天应当有经验丰富的技术人员观察，这一点非常重要，因为细菌检测当天的只能做回顾性分析，48小时检测只对生长快速、细菌密度大的起作用。0 B2 y0 j& V: y1 G  D, }5 l
答4：目前是这样处理，收集是正常离心收集，细胞回输前2天做内毒素，支原体衣原体细菌培养（这个需要24小时出结果，在回输时确保细胞质量），回输时做流式，收集后最快的速度回输，至于保存，短期4度（不推荐），长期就是冻存呗。
# {6 ]$ p' a2 F; H; W7 f问9：CIK 细胞临床输注疑问。CIK 细胞收获后送至临床科室给病人回输，但是回输时护士经常发现血袋中有大块大块的白色絮状物，这难道是细胞吗？还是别的物质？怎么解决这个问题呢？% w4 h; Z% S- O% @, p3 z3 d
答1：1、小心栓塞，一定的用带滤膜的输液器。
$ L5 X/ Q0 O& ^2、那些是死细胞，大块大块的就是大量大量的死细胞，你们的病人真可怜。: j' f! J: c0 [4 }& d& m5 s, n+ L
答2：主要是细胞碎裂释放的核酸将细胞缠绕在一起了，解决办法
: N# H& l4 N# p! F) h1、保证收获前的细胞状态
* A% n  x( S& v1 W/ \2、收获后尽早回输. 6 h" y* S' t/ @0 E$ J: `* s
3、添加1%人血白蛋白
2 p: n/ A  {5 k" y4、从实验室送至临床科室途中避免震荡
0 `, j8 }: l, d答3：你们收获的时候要先过一遍滤膜，不能全指望输液器的滤膜，对病人负责一点
2 A* l; c2 m$ ?& L+ @; Z/ x4 u答4：尽量打散吧，实在打不散的用过滤器，我们输注的时候用输血器的。输液器和输液器都有滤膜的。输血器的孔径大些。" n/ V. R/ A* U0 }4 t% ~  p
答5：解决办法：. {- a- Q; q& L% D6 }# y7 ?
1.添加规格20%的人血白蛋白5ml作为稳定剂； 6 m6 @9 d/ G7 x' F/ b2 A
2.镜下观察细胞形态；
2 C5 H& a- q; @+ O/ `# _5 v3.抽样做细胞染色测定活率；3 B, T% |# H6 d$ O
4.可用鲎试剂做内毒素检测进一步验证；% s! e- _! S( y8 U8 S5 g
5.参考细胞回输前真菌、支原体培养结果。/ l) j5 I/ A8 I+ i5 ]% N; z
答6：确定哪些絮状物质在经过轻摇后会不会散开，有条件就把它取出来镜下看看。
, E& c3 I& @: {' l; b% k0 M/ i1：使用输血用的输液器*8 e4 ]( O1 \' F+ A" u! ~
2：添加人白蛋白
  @8 S' ]% B% _+ e0 M  X3：收集后不要停放，最好是收集就回输，避免死细胞过多。5 o, l7 E, u/ A  l% h
另外就是自己统计测评一下以后出现絮状物的情况，或许是你自己操作中存在一些东西吧。 / G2 ?# O; m2 I; U
总之小心为是。
6 B4 b3 }- I1 o- m0 V答7：用10um的滤网过滤一下，这样就不会有大的团块，另外加白蛋白也很重要
* u5 z1 q$ L$ \& U& t( |8 O4 \答8：回输前，用70um的滤网过滤细胞悬液。0.22um的是用来过滤细菌的，0.1um过滤支原体。5 t. ^6 p% A' U' L' x( }+ N
问10：用细胞培养袋培养CIK。用细胞培养袋培养CIK，收获细胞有什么好方法啊，用离心管太麻烦了,计划用1L的细胞培养袋，收获细胞时候，直接离心细胞培养袋，用血浆夹排出大部分的培养基，再用离心管离心，这样可行吗，请教用过细胞培养袋的老师
0 `# H/ ~! a: o+ r答1：这个估计不大行吧  呵呵 首先估计你用的离心机都没有适合把培养袋垂直固定的 （转自干细胞之家）解决了这个问题你这个是可以考虑直接离心培养袋的  但是离心后的洗涤估计也是个麻烦的过程 还不如直接用离心管呢  无非就是多浪费几个离心管的问题1 b/ C8 T6 \6 o
答2：可以用离心瓶啊，有尖底的500ml离心瓶，一次离差不多2升，更大的就是750ml的平底离心瓶了。离心机Thermofisher Multifuge X3就可以满足需求，我们实验室就有一台。
+ l8 U8 b7 _7 E5 ^0 a答3：可以用250ML的离心管，康宁的活BD的都可以，既有效率又好操作。4 r5 n7 q. l- b0 ~7 i
答4：k可以用一次性的离心杯（500mL/250mL），一次四个就够了，安全方便快捷！
* U7 T7 ?, v, {3 K. n7 t答5：有特定的离心管的 如225ml 250ml 离心管 有需要的话还可以定做更大容量的离心管 一个培养袋顶多就3L左右，应该是足够的$ @* \* V: X. _5 {3 v: G% q
问11：eBioscience CD3单抗配制。请问谁用过eBioscience CD3单抗 货号是14-0039，请问是用什么溶解的啊？
3 a( l/ h- e2 t2 }$ I0 ?: Y答1：用1xPBS溶解，单抗是球蛋白，有重链和轻链，两者靠二硫键连接，长期存放在4摄氏度二硫键打开，抗体就降解了。PBS能使抗体处于一个缓冲体系当中，相对于用DD水溶解要存放的旧。溶解时要注意，溶解成高浓度母液，分装小管，-20摄氏度保存，用的时候解冻，最好一次用完，4摄氏度存放不要大于2周，略有降解。& }1 l1 D! E5 n1 A0 M. l$ u% q% E* X
答2：要无菌的pbs会好一点，最好是0.22um过滤啦~\(≧▽≦)/~啦啦啦。1mg或者2mg溶解到1ml的pbs里面，50uL每管，分装20管。。。。。用的时候多方便啊。
- c! e8 u' T$ w5 y+ x; a答3：eBioscience这个14-0039的全称是Anti-Human CD3 Purified，一共有两个包装25ug和100ug。但是出厂浓度都是0.5mg/ml，厂家推荐染色体系是：0.25ug/100ul/105E~10E8cell，但是厂家推荐的量一般都较大，因为他要保证你有充足的抗体可以与你的目标分子结合，所以他推荐的量一般不要超量，除非您的细胞量很大，体系很大。您问的这种情况，我不知道您是要稀释分装保存，还是正式试验过程中需要同时操作多个样品，而稀释抗体来染色，一般不建议对原厂的东西进行稀释保存，而是在试验过程中稀释成工作浓度来现配现用，用灭菌的PBS稀释就可以。) I! @, v2 @2 D! ~* G4 j
问12：CIK细胞换液问题，求解，谢谢。CIK细胞一般都是向培养瓶中添加含IL-2的培养基，是不是每次添加都要对细胞进行计数，保持每ml细胞量为1*10 6次方？一般是2-3天添加一次吗，每次都是扩一倍？求解答，谢谢& Q$ Z, l& }& K
答1：保证CIK的密度维持在1-2*106是最好的，不必每次都计数，在扩大培养容器时，比如T75转到T225时计数就可以了。
" L* A2 X4 x3 O0 y. @) V答2：不用每次都计数，细胞密度保持适中即可，扩大倍数根据细胞生长状况决定，通常隔1-2天补液一次。
& N# G2 k5 [2 e3 k4 Z答3：不用每次计数，那样很麻烦的。根据细胞长的快慢，而决定补液时间，通常隔一天补液一次。
8 k1 b1 s! V3 I; z* p6 h答4：不需要计数。。在显微镜下查看细胞状态。太密集了 就要加液。。。培养基太黄了 也需要加液。
0 i8 g- I; _2 i( n" e答5：至于每次补液的体积。。要看你细胞的密度。。你可以根据你第一次加液的情况。看细胞密度大约是什么样子。。。然后细胞增值后。。加液前先混匀，在确定补加多少。。。差不多就可以了。。没必要那么严格。。
8 P4 V# w1 n4 \6 W/ A答6：哦，明白了，那我一开始是20ML，后来补液是隔一天加10ML，应该差不多吧，我看文献说一般16-17天就可以收细胞了，达到10的九次方数量级。
  ?6 T9 V4 q: X2 X8 l6 [答7：楼主如果是搞科研的建议每次加液前给细胞记下数，如果是大规模的商业生产，就没必要计数了，细胞生长要有一定的细胞浓度，太低了不利于细胞增殖，太高了营养物质容易跟不上，细胞量大起来就扩一倍吧，不一定就是2-3天添加一次
+ h4 b0 Q/ p: v2 {" w8 a: E答8：也没必要隔天加。。后期等细胞长起来后，可以一次加几百。。 经常处理细胞也会增加污染的几率。! Y. g. Q8 Z6 y5 m5 x1 k9 S
问13：AB血清的选择。请教高手，CIK培养，如果我要加AB血清，什么品牌好，商业化的，以免异体的血浆不怎么纯) l- A* K6 ~: s6 i: Z
答1：人的血清血浆没有商业化的哦。如果你们和血站有联系，可以试试搞点AB血浆或血清，然后处理去掉纤维蛋白原（血站血清都很少的，因为血站如果用血液制作血清的话就将血细胞浪费了，最终产品只有血清了）。或者医院体检抽血的AB血集合在一起用用也可以。* S  r5 e, w" O8 m4 c& Z
答2：是的，同意yongqingsun的说法，添加自体血浆比较好，建议浓度不要大于10%，4-5%比较好一些，同时选用无血清培养基就可以了
+ _8 o! @6 d" ?答3：楼上几位说到添加自体血浆都是对的。况且自体血浆的制备也很简单，我们实验室是这样做的，您可参考：抗凝外周血50ml，700g离心力下室温离心20min；吸取血浆6ml，置于水浴锅56℃ ，30min；然后4℃，900g离心力离心30min，取自体血浆4℃ 保存备用。/ X7 r4 M4 I' _4 _0 Z
问14：请教DC培养用细胞因子的牌子。最近我们实验室想研究一下人的DC细胞，寻找了一下网上的一些文献，咨询过几个品牌的IL-4 、GM-CSF和TNF-α，价格都很贵。所以，我想请教一下大家，你们实验室这几个细胞因子都是选用哪家的，最好性价比高一些，十分感谢！！  还有个请教的地方，你们还添加了其他细胞因子吗？
* m& _: D/ s  a- _& B答1：peprotech" F6 z+ u2 l6 A2 M4 h1 m
答2：厦门特宝
$ R. T% D% [4 {0 o" \答3：因子进口的没有便宜的，peprotech也不便宜，我觉得既然做DC质量还是第一位的。做DC既可以用6孔板又可以用培养瓶。5 s/ q+ a, `! ^4 |6 l
答4：进口的因子质量有保证，价格较高，做DC根据实验要求选择用6孔板或培养瓶及培养袋均可。可否考虑用人源化Humanzyme的IL-4和GM-SCF，cytosale公司有成形的试剂盒，使用更方便。% ?% i# W$ {. f2 P
问15：十分急!!麻烦各位师兄指导一下!! 我最近在培养CIK细胞，因假期关系，没有时间做传代培养，因而有细胞的数目好像太多了(我发现在培养液表面有一些白蒙蒙的液体)，还有在培养皿底部，我将培养皿慢慢倾斜，发现有很多”灰尘”的液体。而我没有理会，我将细胞回输到病人身上，但病人出现发热，发冷，呕吐等问题。我想知道，是不是因为CIK细胞已经老化，所以出现这些问题? 已经老化的CIK细胞不可以用吗?  k# i6 s; _2 K1 v
答1：强烈抗议，这种东东西还敢给病人用？你要是病人或者家属你有啥感想！ 你肯定不是医生，这是害病人啊！你们这家医院肯定没有资质！肯定没有GMP实验室资格，这是拿病人生命开玩笑，自己都没把握的东西给病人数到血液里！中国有这种医院和实验者真是搞不好了！建议网站人肉搜索这家医院并举报！这样下去要害死人的！% v+ Z6 Z) M: n0 d
答2：CIK细胞在回输前必须严格进行细菌、真菌、支原体、内毒素检测，只有全部检测合格才能给病人回输。看来楼主是完全没有进行以上检测啊！( z; G5 J& I( y- W) v/ ?
答3：楼主的提问暴露出了很多问题，首先就是责任问题，看这么多人的愤慨，楼主你们实验室（科室？）的确应该好好地反省一下。人命关天，如果是技术上的问题还情有可原，毕竟本身选择细胞治疗的人不是到了逼不得已（当然也有可能是被忽悠的不得已？）一般人是不会选择这种治疗的，这一点，从今年很多医院避而不谈细胞治疗的现状可以知道。国家政策也是处于一种暧昧的态度，而我们国人太善于钻营了，反正一切以经济为导向吧。所以搞得细胞治疗遍地开花，但也是问题不断。再者，我觉得楼主在技术层面也的确存在很多问题（如有冒犯，尚请原谅），作为一名科研工作者，您应该对自己所做的东西很了解的，细胞的生长、发育、死亡自有其规律，套用一句陈词，‘这是不以人的意志为转移的’，您怎么可以罔顾细胞规律而享受您的大假呢？而且，从您的描述来看，您似乎既没有对细胞的得率进行计算，换句话说，你也不知道您会输给病人多少量的细胞，一般而言，CIk回输细胞总量要在10的9次方以上才有效果；也没有对其进行霉菌，真菌、细菌等的检测，您也不知道您回输给病人的究竟是什么？当然，从您的描述来看，大部分应该是死亡和凋亡的细胞，这些细胞必然已经改变了其原来的细胞特性，这样的细胞会输给病人其实是在犯罪（谋财害命）。另外一个暴露出来的问题就是，您给病人回输细胞是应该有既定的时间安排的，不可能您想哪天回输就那天回输，也不可能因为您的细胞过多或者要死亡了，您就匆匆忙忙回输。这既是对生命的亵渎，也是对您自己灵魂的践踏。希望楼主能够深刻反思，更希望国内的医疗环境真正的好起来。君子爱财取之以道！% k/ [& Z" J- G+ G# M/ l
问16：CIK细胞结团。这几天培养了一瓶CIK细胞，第二天开始结团，细胞长了但不多，没处理，第三天结的更大摇也没有摇散，离心处理后第五天看还是结团！在网上看有人研究钙离子浓度对293细胞结团有影响，有人培养CHO细胞出现结团时添加硫酸葡聚糖，不知道CIK细胞是否也可以！还有就是那些因素能够影响CIK细胞结团，盼各位高人指教，如有相关的文献盼能上传下！谢谢！
0 r$ \' h  m6 T3 U" }2 ?! d' s答1：CIK细胞结团是正常现象，到后面就没有了，结团说明你养的不错。呵呵
1 C* F7 g! A: o4 i, z# M1 R, a) ]' Z8 \答2：我也觉得细胞出现大的集落是很正常的，不结团的单个细胞数量是不太多的，我养的细胞也多是团的，你得看总量怎么样，比如说铺满了多少，再决定传代什么的
# X2 P6 C2 _7 P$ X答3：CIK细胞培养是这样的,第一天分离出的淋巴细胞是分成单个细胞的,但是随着培养就会结团,肉眼都可以看到,所以每天观察细胞后都要摇一下以达到分散细胞的目的,一般在培养到8-10天以后细胞就开始分散开了.你只要观察细胞活性很好的就不用担心.这是正常的., r4 R  f9 ?6 y3 Z* M- G  }4 W7 W
答4：对呀，CIK细胞结团很正常滴，尤其在培养的前几天，有时候还会成一大团黏黏的东西，会误认为是污染，其实不然。/ s3 G# D9 m5 O; J+ u
答5：细胞数量不是很多时结团的数量也少，培养一段时间后细胞结团几乎占一半，并且体积有大有小，这很正常。0 z" ?0 y  L; q2 P6 e& o3 x5 p. y
答6：在生长初期结团是正常现象，但是根据我培养的情况看，如果到了9-12天的时候仍然出现大量细胞集落，最后的结局极有可能是细胞生长停滞! O5 g, V. q: j- h& h
问17：PBMC分离出来，大家都洗几次，用生理盐水还是PBS？我们用的生理盐水。PBMC分离出来，大家都洗几次，用生理盐水还是PBS？我们用的生理盐水，有没有用PBS洗的，二者区别大不大？细胞洗一次离心一次会不会丢失一部分，或者是对细胞有伤害！
6 w$ U0 p( j' Y! R答1：生理盐水洗三次
5 j3 `( p* B" p" T0 A5 c  f6 u答2：每洗一次就丢失一些，生理盐水是等渗的没有害处。
2 T" q3 v0 |6 x" V$ x7 [' y; I答3：PBS洗3次，效果也不错的，洗的过程肯定会丢失一部分细胞
+ ^5 _$ t7 H# J/ F: R& H: i答4：用生理盐水洗好一点，洗2-3次就行，每次离心都会损失一些细胞，用生理盐水洗没什么损害，但是离心对细胞有一定的损害。
8 l& J. a* O3 H答5：PBS与生理盐水都是等渗液，所以选择哪个洗涤都可以，洗涤一次肯定会丢失一些的。9 @( W+ j- _2 f, U0 n6 K
答6：我们过程中是用生理盐水洗涤两遍，最后用培养基洗涤一次。。 第一次倒掉的杂物较多，后面就比较少了。。。' V# v5 A. v7 P, S0 x8 G
问18：【请教】外周血分单核细胞培养DCs的详细步骤 。主要有几个问题亟待解决7 ~' f" w! {- ]8 B! a2 n' N
1.外周血分淋巴细胞时，梯度离心去除血小板时，离心梯度是怎么设置的？
5 l8 R4 q9 r' J& U8 n$ y! X: u0 c2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：. Q1 [1 n6 u0 g0 |+ D/ [
  A.贴壁时需要加血请吗？需要加细胞因子吗，需要的话加哪些，量是多少？+ I' {# h& |7 N  v
  B.贴壁时间是多长时间，2h还是48h？
( e6 G+ }/ o  A  r) I! e  C.贴壁时是在培养瓶中好还是在六孔板里好？! j$ G2 R. s7 p8 v) M. B. w) u7 ^* x5 G
  D.这一步还有什么要注意的吗？
, a2 S! k& a0 S: ]3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
7 o2 F9 A+ d9 c0 `% o  A.换液间隔怎样？半量换液还是什么其他方式？; N% l. \* H3 c  q, k# E. Q
  B.换液时所用培养液中因子的量是多少？
. H9 H# q+ n# @( B& ?4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：
% J" u; `1 v; P( ?* v  A.在第几天开始诱导？. Z$ ]5 a# l4 D( T9 D/ W
" B* w( n7 \9 u: y" v  B.用什么因子或者药物进行诱导，量是多少？
, I; Q6 O. i( y3 c8 o, m8 ]  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4之类的吗？
" ?8 o0 Z4 h7 l% w4 @( L2 E  D.诱导多长时间可以收获？( u+ X, V+ h, ?* p+ }
1 W! I) S* q( H2 @+ Q" T" ?, p' HP.S. 如果要用荧光腺病毒感染的话，在第几天哪个阶段感染会比较好？
" R/ c! J/ ?4 U' s* i- y& o0 X/ h: `! H答1：1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。
6 |; o* ~: n# @( L; e* y2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时： 1 y! j" z4 c+ V! ~6 T
A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。
) f2 v! v2 G7 x- K8 C. }3 b0 N- dB.贴壁时间是2.5h4 ?6 d% u& X; \# n$ b9 W1 U
C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。.
1 I& L, Y3 y' h3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步： % p. R# |& k/ Z5 R; z. q
A.换液间隔一到两天，半量换液
( q3 n- a' `+ [+ F+ ^. e6 k  R' i1 tB.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-41 e, M4 n! ]" D9 w8 w
4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：  ! Q2 g4 z7 n0 i" |  W& B7 w) w
A.在第五天开始诱导. R" g0 M, f2 d5 R" _8 D$ m$ l" N! d
B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。1 Q6 W3 D, T  j' x5 S/ i
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。
' \- g4 S+ p, D9 c& b# X6 k* ~+ F  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。
* \- E( e: q, u8 ^& m9 c+ ?答2：1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。4 g$ {0 i; f" F' u; ^6 P
2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：
6 m3 d& k4 b* {8 IA.贴壁时不加血清，不加细胞因子。' a% N: y5 r# Z: s# L; W( T6 B! ]! W$ }
B.贴壁时间是2.5h
* |9 x, p! `6 b4 |0 fC.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。
% K# O$ a) m" W6 X1 [3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步： \& g& @6 ^. J# }9 a' w
A.换液间隔一到两天，半量换液2 R) C/ i3 V1 p! e  Q( h
B.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4
' O6 l! U, m3 y9 G3 r/ ?% M4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步： ) D$ D" h3 Q# l( E. W
A.在第五天开始诱导* # T( \5 U* P' n4 x
B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。/ a$ m* h* g% l; O& D  @
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。+ \$ R% q, E& n0 C# D9 U
0 k  B1 i/ m  I& t, v  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。
" I( b5 `( _8 l3 r+ F问19：培养CIK，添加IFN-r与IL-2和CD3的时间差问题。求教各位有经验的前辈。我看论坛上说，培养CIK时，IL-2和CD3要在IFN-r诱导24小时后添加才好，而且一定要超过24小时，那少于24小时有那些不好呢？？细胞增殖不好还是CD3CD56表达率不好？那24h后可以后多少小时呢，后的太久是否也不好？ 比如说我今天晚上9点把细胞种上添加了IFN-r,我是第二天下班前(不到24小时)把CD3和IL-2添加进去呢还是第三天早上上班后添加CD3和IL-2（24小时后又多了12小时）# L4 ]6 P; `- M
答1：一般来说IL-2和CD3要在IFN-r诱导24小时后添加，但是我们经常是没超过24小时添加的，细胞增殖情况和CD3CD56表达率都还行。
/ l; Z' j0 g" C' T) {  _& G细胞你先养着看看，应该没什么问题。下次在做的时候，超过24小时再添加IL-2和CD3，最好再加IL-1，做个粗略的比较。
* d- x# T* T$ c3 B6 J! ]) v答2：最好还是控制在24h之后，不行的也应该在20h后。这样IFN-r诱导的效果要好些。
" U  l+ L( X% A4 G: w4 i答3：我们一般都控制在20小时以后，目前对比没有发现太大影响% g# c- L* [% `. e6 B  U0 N
追问：您好，我看的培养CIK常规方法都很少加IL-1，请问加与不加IL-1对CIK细胞的诱导有区别吗，区别大吗？谢谢+ h. @8 d; p0 t2 b' f& i1 w6 X+ L
答4：IL-1可以介导单个核细胞上表达IL-2 受体,与IFN-γ、CD3合用时可以明显提高CIK 的细胞毒效应,但IL-1 对CIK 细胞扩增不起作用。
# t' ]! L+ W" `# H3 A5 y- p5 R问20：细胞培养袋！！注意事项？经常用细胞培养袋的大侠们，（转自干细胞之家）使用培养袋有什么重要的注意事项吗？ 一般师傅都说不要碰角角棱棱，不要喷酒精，灌液后排气泡:大侠们喷酒精吗？用不用排掉袋子里的气泡？
8 X& l' N0 [7 P$ K5 R6 l答1：我做的时候l要排气泡。袋子是透气的，一般不往上面喷酒精。加液的时候在开口处擦擦酒精。希望有高人专业点解释。。。
) ~! g* ?3 o. F, q, g" R1 s答2：我最近用细胞培养袋培养CIK放进培养箱前都是喷酒精的，没有发现什么异常，排气泡一般是在容积较大，气泡较多时候排，一般不用排1 N; ?( W* Z8 k" A: Z. y/ j' h& i8 V
答3：细胞培养袋的说明上是不能用大量酒精。一般用少量酒精擦拭没遇到过问题。管子里面的气泡是一定要弄掉的。+ ^9 U6 `& P8 r  V5 ~
答4：一般少量酒精还是没大问题的 ，尽快用纱布擦干， 气泡的话比较少量的话问题不大，如果多的话就要排出气泡。。1 F: [! ^$ o4 m) k: r! C: ^
问21：免疫细胞细胞因子。国产的细胞因子分装冻存，-40℃能用多久？求高手
4 K* D' m. x4 m" d' x答1：根据产品说明进行保存，不同的因子还是有差别的，一般整支的干粉-20℃保存就行，分装好根据你的使用情况保存，短时间-20℃就行，时间长的话，可以放在-80℃深低温冰箱保存。
3 X, U. _4 V: Q6 _: h2 x答2：分装因子时，可以分装成1000X的存储液，分装量根据因子添加量而定，最好一次就用完一个分装量。% p: [( b. k0 k- {8 `
只要不反复冻溶，分装时严格按照因子说明书标注的溶解液种类、用量进行操作。! g6 Q" p- `- n
加完溶解介质后，轻轻拨动几下，使其混匀，最好不用枪尖吹打。然后放置到4℃，静置1h，让因子充分溶解后在分装。) x$ I0 Y7 u$ o. t0 m
7 x, g; F- F$ X# H9 N分装时使用的枪尖和EP管，用低吸附的。用之前再用蛋白封闭处理（一般是0.1%的BSA）。( J$ I* o; K: Y, S. ~6 n
个人建议，仅供参考。/ P2 M9 Q" X- x8 v3 \3 K  z# `. o
问22：求cik细胞培养的一些知识。我是新手，最近在养cik，做CD3+\CD4+30%，CD56+20%,这个指标算好吗？如果不好，大家有什么好的建议没有？谢谢了。还有培养瓶内有很多杂的小细胞，对细胞培养有影响吗？, W8 k; _8 a# j* Y) O
答1：这几个指标还算可以的,CD3+细胞在70%-80%之间比较合理，CD3+CD56+在15%-30%之间。培养瓶中很多杂的小细胞是不是你提取单个核的时候有很多红细胞，在培养时红细胞死去剩下的碎片啊。最好还是上个图2 e$ H& f' W$ G7 w7 N
答2：培养的不错，不管谁培养里边总会有杂细胞，这样当然是会影响培养了，至少这些杂细胞在消耗培养基中的营养物质。不过这也没办法，只能尽量的降低杂细胞的含量了。$ E5 i* ?# f" }3 K; q$ N
答3：NK细胞标记CD+16CD56+，NKT细胞标记CD3+CD56+，T细胞标记CD3+。我认为这个结果还是比较好的，一般NKT>20%,CD4+CD25+<10%,CD3+和NK再高一些就很好了.
2 ?" q' x% J# G: J6 ^. x答4：CD3+应该说有点低。“CD56+1.5%，CD3+CD56+28%”，CD56+的数据搞错了吧，你后面CD3+CD56+28%，CD56+包括CD3+CD56+与CD3-CD56+。测的时候最好能测一下CD3-CD56+，如果CD3-CD56+较高，而CD3+还是较低，那就说明CIK里面NK细胞较多了& J/ j$ W# Y) `" {
问23：PBMC提取已经摸索好了，准备摸索CIK，麻烦懂的人进来看一下，万分感谢。前段时间一直在摸索PBMC，基本上已经摸索好了，现在准备开始做CIK了，但仍有几个问题不明，请知道的朋友解答一下，万分感激，呵呵！
6 [) m2 J2 c) Q& b. m' O( F1.PBMC提取完之后，我准备放到直径为100mm的细胞培养皿中培养，问题是PBMC的量是多少，我在文献中看到的是1x10 6/ml，那一开始加10ML培养基的话，那就要1x10 7的细胞，是否比较多了？？？ 2.培养CIK一般利用什么培养工具培养？如果我一开始用直径为100mm的细胞培养皿，养到多少天后换成培养瓶（还是培养袋？），用什么规格的培养瓶或者培养袋？？？换液和传代的时候是否要离心？ 3.我采用的方法是于当天加入rh IFN-r 1000U/ml（请问是提取完PBMC立马加入，还是PBMC培养了2H吸取上清后加入），放置5%CO2、37oC孵箱中培养24h后，加入CD3 mAb 50ng/ml、及rhIL-2 1000U/ml继续培养，每3d换液并补充rh IL-2，培养至第14、15天，终细胞数为2x10 9-3x10 9。不知道这种方法是否可行，还是现在还有什么更好的方法，望赐教。4.CIK培养完成后，一般是用什么方法检测，看的比较多的是流式细胞检测CD3，CD4，CD8，CD56，这种检测方法是否能够说明问题？？？
& b! Q; }. c6 f6 o) I答1：1..你用的这个密度是比较普遍的，没有什么问题，（转自干细胞之家）只是我不大明白为何用培养皿来养，开始就可以用培养瓶，我觉得。
( g, c6 p) P* e, n% `- B8 T2.用多大的培养瓶取决于你养的体系有多大，T75和T175都可以的。培养袋也有不同规格的供应。, |: \  u" Z3 s+ _' }
3.如果你不养DC细胞，大可以在PBMC提取完就可以加IFN的，不用等待2小时。你所说的这种方法很通用的，有的人可能还会加下白介1。如果你最终得到如上的培养量是由1乘10的7次方扩增来的，我觉得量还是可以的了。; Z; {& S# F# J1 S  Z
5.关于流式鉴定，很多人把CD3CD56双阳性细胞的比例作为一个标准。但是也有人会有其他看法，认为不一定如此。4 l% n6 F0 Q- l& P! ]9 s. J
以上仅供参考
( j/ U/ F$ Y/ K( c答2：我的回答和楼上的差不多+ W" P6 l# ?  F
1.如果只做CIK培养的话，直接用培养瓶就可以了，一般有人分离PBMC后放在培养皿里，是为了分离贴壁细胞做培养DC用。如 不做DC就可约去这步。) D4 `" q- W: `# }
2.如果做预实验可用小规格的培养瓶，T25、T75都行，细胞多了就可以丢弃一些。若是用于临床的话就最好用大的培养瓶或者培养袋了，这样操作起来更方便，也节约耗材成本，若用小培养瓶，需要的瓶子太多，增加工作量。  L# r) |8 v& T5 F& l- A5 ?  j6 x
3.因子浓度可以，加入的顺序也对。如只做CIK就直接分离完PBMC就可以加IFN-r了，若是也要做DC，就需要贴壁两小时，贴壁细胞作诱导DC用，悬浮细胞作诱导CIK细胞用。
  P$ P9 d# B1 A- e+ i, Y2 ^5 M4，流式检测主要就是你说的那几个。
+ b, B; M3 o- b追问1：回复 花饶然 的帖子* d  G7 b9 D0 b0 t* i' n
非常感谢您的解答，我还有一个细节方面的问题，就是我如果放在T75（250ML)培养瓶中培养，先按照细胞浓度加培养基，比如说我先加了10ML，然后3天后，细胞浓度增加了，我是直接在里面加培养基，还是需要把细胞离心后再换培养基呢？同样如果细胞浓度增加到需要传代（需要多个瓶子养）的时候，是直接将原来培养液分为多份移到新培养瓶中，还是需要离心后，用新培养液分至培养瓶啊
& C$ C" y/ \# ~# r3 C, b0 V5 M$ ?还有一个关于试剂的问题，培养基中加的CD3单抗是不是就是用来流式检测的CD3一抗，两者是一个东西吧
. Z! v7 f1 w2 |* Q% ~; E+ B追问2：再追加一个问题，就是如果从第一天（提出PBMC后加RH IFN-r）开始算，大概多少天能够诱导为CIK（能够通过流式检测出CIK）？？？？？？是不是随着培养时间的深入，CIK会越来越多，CIK本身会增殖吗？还是什么情况？？？？？？一般需要多少天能将原来1*10 7细胞量的PBMC诱导为终细胞数为2x10 9-3x10 9 CIK？？？？？？谢谢！: t, [% K1 t8 T* k; h1 R+ f+ K
答3：不是。培养用的抗体和流式检测的抗体不一样。( n0 X$ Q# r+ Q  I
答4：这个看细胞生长情况了，有的是直接加入新的培养基有的是半量换液，目的就是保证细胞的密度始终一致，我们采用的是半量换液。刚开始是离心了之后又换液的，但是后来发现离心不仅会损失细胞而且会破坏细胞，所以我们就没有离心了，直接换液。
5 a; x5 I! w, K- v答5：如果你第一天是这么算的话那养成CIK在15-22天吧。CIK培养就是你就随着细胞增长随着添液就是，还有你是打算用的什么培养基？是做临床还是做研究？
2 f7 p5 G( [5 M3 n; l( i) ^答6：临床是要用无血清培养基的，因为临床采血一般在50ml左右，离心下来自体血浆只有20-30ml，而临床上异体血浆是不允许的。
7 D9 j3 a6 Q* B4 I我是用自己研制的，具体情况在给你的另一个回复里说了。  K. g! i( w& p4 V: _' `) H8 S/ h
PS：临床的安全性没有问题，有医院检验科的第三方检验报告。
( [+ w8 j4 U) |+ h问24：求助CIK临床回输的时候人血白蛋白用多大浓度比较好啊。CIK临床回输的时候人血白蛋白用多大浓度比较好啊& Y% C$ _/ r  j, B+ U0 Z1 }6 k
答1：有人用的是1g/500ml（生理盐水）
" y; k0 t7 C# c1 ]! X* w2 Q3 V答2：100ml生理盐水 加 25%人白蛋白 5ml: z' U# R$ W9 H4 O* I/ w/ {
答3：也有200ml生理盐水里面加4g人白的~
  d* w. W$ D/ n1 T$ c) i答4：100ml生理盐水里面加4g人白蛋白，起到稳定及缓冲作用。1 m7 L4 S& i! I
答5：我这边加质量分数1%的白蛋白
) u: W8 c3 U8 Z9 K5 I4 `答6：加白蛋白的作用可以起到营养细胞的作用，还可以防止细胞聚集成团，当然白蛋白本身输入人体也是有一定的治疗作用的。# S7 _) T# e$ F4 T& a7 z
问25：【请教】 请问CIK培养时换液的依据。请问在CIK培养的过程中，什么时间点加液？ 是半量换液好还是补液好？ 补液补多少量，依据是什么？什么时候是扩瓶的最佳时刻？% q: E* w1 l5 C4 K' Q2 b
请各位帮忙解答，不胜感谢！; Z6 x3 d  J/ i! p9 B3 P
答1：在CIK培养的过程中，第三天或四天如果细胞状态差，集落少，杂质多，可半量换液。状态好，加等量培养基，补充rhIL-2。第六天或七天，计数，然，调整细胞浓度始终为（1-2）×106/ml，加适量培养基。第八天或九天计数，调整细胞浓度始终为（1-2）×106/ml，加适量培养基。后面也是这样加。
  ?/ u# |7 U$ ^答2：CIK细胞在第五天时补液扩瓶就好了) }" t' M: [' V1 ]4 o" `
答3：6、7天之后换液时需要补加IL-2，其他的不用加。
; w- s, y  Y7 p答4：我们只补液，不换液，补液同时补IL-2
* `$ H$ a& _* O# m4 H答5：培养过程中不换液，一般2-3天等量补液，不过这也要根据细胞的生长具体情况来定，我是一般看到培养基颜色明显变黄，镜下形成较多细胞团就补液了，除了第2天补充各种细胞因子外，我们培养后期的补液都是补含有IL-2的完全培养基（含双抗，FBS的1640）.7 |0 ?8 ]2 H+ ]- B% ?" Z0 r
答6：补液只需加IL-2，IFN和CD3不需要再补加，细胞密度很大的时候，比如3*106/ml的时候需要扩瓶或转到培养袋中培养啦，CIK细胞增殖很快的。在细胞生长期，每次补液的时候密度调到1*106/ml。
! l6 c- I/ a# s7 d3 m; O问26：关于CIK细胞培养天数的问题，请教大神，谢谢 。如果从第一天（提出PBMC后加RH IFN-r）开始算，大概多少天能够诱导为CIK（能够通过流式检测出CIK）？？？？？？是不是随着培养时间的深入，CIK会越来越多，CIK本身会增殖吗？还是什么情况？？？？？？一般需要多少天能将原来1*10 7细胞量的PBMC诱导为终细胞数为2x10 9-3x10 9 CIK？？？？？？谢谢！
/ T( W& t5 Q: w$ I0 {+ `1 A, k答1：一般的外周血来源的CIK培养至两周至三周左右就能够达到10的9次方数量级，但是CIK得数量不会一直增多，在2周左右达到对数期，之后就会到达平台期数量不再增多。我们都是在第一天加入IFN-γ之后24h再加入IL-2、CD3，每2-3天半量换液。我觉得应该在加入诱导因子后就会有CIK产生的吧，只是数量会随着诱导时间的延长而增加。
6 O; D) X5 I' F) a: E9 F2 z1 g答2：按照楼主的时间算法要是想做有关CIK的检测一般是在15-22天，（转自干细胞之家）也就是2-3周，培养期间会有个指数期（如果不是包被一般在第5-6天至第14-15天），这段时间是数量增长的关键，之后细胞增值速度回慢慢减慢，30多天之后开始慢慢出现死亡，细胞会减少。
3 ~7 ~0 \9 m9 F问27：培养瓶可以竖着放吗？我们实验室用的培养瓶是600ml瓶子，，我们最近由于特殊情况需要加液至300ml，如果躺着放的话会碰到瓶口，我想竖着放可以吗？我们养的是CIK。谢谢各位的指导。# C3 E& S- m1 t1 l
答1：横着放的话，和CO2接触的面积大一些，PH平衡效果好，竖着放也没什么影响吧，要是培养出问题了，可以试着调整一下CO2的浓度。4 Y. J; C4 ]' `# S
答2：我觉得会有影响，首先影响气体交换，另外虽然CIK是悬浮细胞，但竖着放也会使细胞大部分沉积到培养瓶底部导致局部密度过高。: H8 Z2 D9 n  G0 D
答3：培养瓶竖着放置与外界的气体交换面积一下子就会小很多倍，培养液的PH值可能会受到影响，从而影响细胞的质量: j1 q' v% ^1 O' h. f
答4：暂时放一下没问题，但要一直用来养细胞就不要了，因为竖着的液体与CO2、O2接触面小，绝对会影响细胞生长。4 Q4 z8 {3 U  s$ G8 h1 J1 P
答5：可以考虑用细胞培养袋，TAKARA的培养袋相对便宜些，
( a4 C! L1 }& x# L问28：DC 如何收获。请问大家一个问题：树突状细胞培养7天后要收获，该采取哪种方法？是直接用PBS冲洗下来还是用胰酶消化后洗涤后收集？5 M5 K. }) {9 J( C3 s$ u% R
答1：细胞刮刀刮
% Y$ Y; a* K3 u. O答2：4度盐水冲洗
- o1 B5 w1 ]( X, f& t: H答3：大致是以下步骤：5 B* ?; T2 b1 [; ^2 t1 x1 i0 k/ y/ K( U8 T7 E& h
把培养液吸出4 ]! X  @: V/ P' V
4 W: ]7 a/ G) F→加入适量生理盐水（75cm&sup2;培养瓶10ml左右）' y- S5 {1 i9 Z' E! J% F' G
→把培养瓶平放，来回摇晃几下
! u( k$ t+ ]6 c2 G→吸出盐水，重复以上步骤清洗2-3次. S; L" e+ L2 c, Q4 c0 [
→加入适量生理盐水
& O9 T2 Z; G: D9 k* T5 O% ~( c→用移液管来回吹打细胞，使细胞脱落$ o; k  y1 X& x
→平放培养瓶，用力拍打，再吹打→显微镜下观察& K  r, Y4 r0 v" \! w7 J: c
→拍打，吹打，观察% O. j' j9 `5 ], G
$ f* s) k/ W+ I. Y3 O& h! H→细胞全部脱落→…………
: k" T5 S. D5 O& m- u) p2 W+ V答4：一般轻轻吹打成熟DC就可以从瓶底下来。4 ~8 b; }+ a6 r* t' r
答5：要用细胞刮进行物理作用，否则很难使细胞完全掉下来，对细胞没有什么伤害，细胞的存活率依然很高，直接用生理盐水吹是不能完全吹不下来的。+ }' {& g# r7 F2 h# N4 A$ g; }
问29：从血液中分离细胞时，红细胞过多会不会对培养细胞有影响？我从外周血中分离淋巴细胞培养CIK，用的是天津灏洋的人淋巴细胞分离液。有时候收集细胞时红细胞很多，我想问问如果红细胞过多会不会对培养CIK细胞有影响？？？
0 R5 I& z+ T3 I. e2 X( o答1：一般情况下没有问题的，会自己崩解掉的！
2 [2 |: d; R  I; w答2：基本没问题，标准CIK培养都在2周以上，体外培养超过两周，红细胞所剩很少了。如果3周，红细胞基本没有了。9 s- M7 {) V4 k& N4 c, s
答3：红细胞过多，细胞状态很好。7 c/ T/ F$ J1 _* L4 ?; F0 a1 A4 H  C' l9 c- d0 @4 u9 Q2 h; b3 ]
少量红细胞，就不需要处理，在培养过程中会自动凋亡。( w7 y& `2 _3 L
2 @0 U5 u7 t. w+ a0 E* w但如果红细胞过多，会影响后续的使用，建议进一步去除红细胞。2 `$ A& u. i0 p* g
答4：我们用的也是天津灏洋的淋巴细胞分离液，效果还可以，剩余的少量的红细胞基本在培养的过程中基本上自己降解了。
' C+ }" _1 G! M6 K/ S% U问30：请问大家培养CIK细胞，用国产还是进口的细胞因子？请问大家培养CIK细胞，用国产还是进口的细胞因子？尤其是抗人CD3单克隆抗体。谢谢！* [- R% t8 @; S6 j
答1：国产的也有，进口的也有。国产的效价一般都有问题，进口的质量好。但国产的稍便宜，我们用时加大剂量。|抗人CD3单克隆抗体最好用进口的+ R4 D, Z  V% @' `& M7 X
答2：il2可以用国产的，临床注射用的那种就行
% d) I+ e( m) x6 b2 G9 c问31：CIK细胞培养基础问题。请问各位前辈CIK细胞怎么换液，传代？长到什么程度就可以传代了，最好是给个图。谢谢大家！
# f6 y9 @7 ?- X. S- M  n! @答1：CIK是悬浮培养，一般培养基颜色变黄后就可以换液，不知道你用什么瓶子还是袋子培养？我们一般2天转一次。( D) `7 o# W  v: N' W1 K
答2：1. 悬浮细胞传代，一般待培养基开始变黄时，将培养瓶平置，于显微镜下观察，若细胞能铺满整个瓶底就说明要传代了。一般2天就可以铺满。8 `8 g* X/ w. g& r9 ~8 M) \, J. o* P: j
2. 传代：如果需要做实验大量扩增细胞的话，可以传代前先将培养瓶直立静置，待大部分细胞都沉降的细胞瓶底后，轻轻吸出培养基，再加入新鲜培养基分瓶培养即可。这样细胞数目不会损失多少，而且上层吸去的也是死细胞。
$ x7 k% y  v( g2 ^$ I/ F3. 如果暂时不需要做实验，只是维持传代的话，只要将大部分培养基吸去，留一点儿在瓶底，再加入新鲜培养基即可。7 E# P& S( f  |% ~3 G
问32：CIK细胞培养问题。最近我们实验室养CIK细胞，细胞长不起来而且容易成团，同时细胞的大小和折光性也不好，怀疑是IL-2的活性不够，后来换了一批IL-2后细胞也长起来了，细胞也变大了，折光性也好了。在别的论坛有提到养细胞前要做细胞因子的活性检测，不知道大家对CIK细胞培养中用到的IL-2 CD3和INF活性是如何检测的！还有有文献说CD3能够促进细胞有丝分裂这个说法对嘛？细胞长起来与CD3关系很大嘛？CD3的主要作用不是诱导成CD3CD56双阳性细胞嘛，难道也用来促进CIK细胞生长？求各位大侠指教，谢谢！  G( P& e% x+ G" S
答1：CD3确实有促进细胞增殖的作用，通过刺激CD3-MHC复合体。双阳性的细胞，不是某个因子说诱导就能诱导成功的，个人感觉更像是不同因子在不同时间段对整个异质性细胞群的筛选而出。9 u/ P. I; l4 d9 p7 @' c