求助 SD大鼠脂肪间充质干细胞培养，总出现问题

yabuhao

试着提取SD大鼠原代脂肪来源间充质干细胞有一段时间了，总是出现问题，请大家帮下忙，谢谢！, R. M1 X+ H- _7 d; h
目前采用的方法：8 U. w8 P4 F: W9 Q0 H- N: r3 ^" T5 p
1.        8周龄SPF级雌性SD大鼠180-200g，禁食不禁水12小时，1.5%戊巴比妥钠3ml/Kg腹腔注射麻醉。取双侧腹股沟脂肪垫（总体积1.5-2ml左右），置于无菌PBS中。
0 [. O7 \# A0 d8 B2.        脂肪组织以PBS冲洗2-3次，先除去肉眼可见的血管和筋膜纤维。眼科剪将组织剪碎为1mm，再次PBS冲洗2-3次。& H7 G, `, A, d
3.        加入组织体积3倍的0.075% I 型胶原酶，37℃水浴锅中消化 20-30min，其间每5min充分震荡。
/ t# Q8 s# R2 _4.        以等体积含10%胎牛血清DMEM/F12培养基终止消化，滴管吹吸将细胞充分吹散，静置5-10min，1500rpm离心10min，弃上层液体及漂浮组织残渣。
! ], T0 C$ g% W5 m  |5 }. r5.        加入DMEM/F12+10%FBS培养基4ml重悬细胞团，接种于1个25cm培养瓶。37℃，5%二氧化碳浓度，饱和湿度培养。48h后首次换液，此后每3天换液一次。
  h1 T6 w& i2 O! R. I0 E问题：
: s% g8 X4 d/ [" H1.        消化30min，得到细胞量较多，但贴壁者少，现20d达80%；延长消化时间至60min后细胞量增多，48h换液时可达50+%，但随即72h后呈簇状生长（未吹匀？），大量细胞脂肪变（50-80%），簇状生长细胞集落中心细胞脂肪变显著。是否与换液时间有关？细胞密度相关？消化时间长，细胞老化相关？PBS冲洗，换液后稍有好转。因簇状生长，故0.25%胰酶重铺一次后大量死亡细胞，或等待细胞集落部分融合后重铺？ : `. l, }* n: Q5 a* L2 E
2.        大鼠周龄选择？是否需要再年轻一点的？( a4 G/ \8 X* g9 |+ K
3.        细胞筛是否必须要用？
( r8 B  Y1 n3 f# f2 ~1 V4.        重铺后细胞死亡是否和胰酶浓度相关，曾见过有人提议0.04%胰酶用于原代
& N7 s( R8 n+ a1 z6.        细胞如何纯化，是否能从形态上区分成纤维？看过几篇文章成纤维和脂肪间充质干细胞的免疫表型也很类似，那么是否只能从多向分化潜能区分？那么又如何能确认酶消化法得到的是干细胞而不是成纤维？- M  `% i0 `& O- |
请专家们帮帮忙啊，多谢！ ' y( g3 }/ E  O. X

yabuhao

另外，胶原酶消化后是直接离心还是培养基血清终止消化后离心？血清似乎对胶原酶不起什么作用吧？

sunnyhuan0629

可以尝试换一种消化酶，将消化酶的作用时间缩短试试看，毕竟酶的作用会对细胞有所损害，需要及时彻底离心去除。去除上清液之后还可以再用PBS洗一遍试试看。另外，在重悬的时候，可以适当添加2uM终浓度的ROCK INHIBITOR试一试，可以帮助保持细胞活力，促进细胞贴壁的。不晓得能不能帮得上你。

yabuhao

回复 sunnyhuan0629 的帖子+ p, j' b% h, o3 ?- x* ]
2 Y3 f  @! ?2 }( \4 M6 e
谢谢您，那去除上清后PBS冲洗的话再离心，这样多次离心会对细胞造成伤害吗？

sunnyhuan0629

回复 yabuhao 的帖子# o% F: x1 {6 r( U9 u5 H$ e

0 ?8 T& I5 G9 G; L3 u一般一次PBS冲洗，再离心，伤害不会很大，在细胞可接受的范围内，当然你得注意，用PBS洗的时候，移液器吹打不可用力过猛，应该尽量轻柔。这也是为什么在之后的重悬时建议加一些ROCK INHIBITOR的原因啦。嘿嘿，不客气，我们这么做，我也是建议。还得看你自己分析呢。