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本帖最后由 tess1029 于 2015-4-16 14:44 编辑 ! W: n& h* M% y( r
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骨髓间充质干细胞（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）具有向神经细胞、肌细胞、骨和软骨细胞等多种组织分化的潜能，被多个学科争先进行研究，但到目前为止，仍有很多领域存在尚未解决的问题，严重限制了其广泛的临床应用。
+ C6 z% U, ]6 b6 g 作为干细胞，其自我更新和不断增殖潜能使其有可能存在类似于肿瘤细胞的增殖特征，特别是长期体外培养的干细胞可能发生异质性问题，这一问题已被少数研究机构报道，但结论不一而足。ＢＭＳＣｓ在动物骨髓中广泛存在，是一种具备可以自我更新和多分化潜能的前体细胞，即便在机体组织细胞受到损伤后，其修复过程也可以发挥重要作用。因其在体外容易获得和扩增，相较于胚胎干细胞、脐血干细胞或神经干细胞，伦理学限制较少，易于实验室工作的大范围展开。
( n, R/ ^/ w* f 近年来围绕ＢＭＳＣｓ的组织损伤反应性及其多胚层分化潜能，多学科的相关性研究相继展开，通过血清依赖实验可以看出，在低血清的培养条件下，所有传代次数的ＢＭＳＣｓ在４ｄ内全部死亡，但是Ｃ６胶质瘤细胞却不同，在同样条件下，该细胞可以一直存活１１ｄ，体现出了更强的生长活性，具有更好的低营养抵抗能力如心肌梗死组织的替代、骨或肌腱组织的再生、神经退行性疾病的功能恢复等。由于这些领域几乎均需要体外扩增出足够的细胞数量以用于ＢＭＳＣｓ移植或基因修饰，因此一个不可回避的问题是这些长期体外扩增培养的ＢＭＳＣｓ的性状稳定性与应用安全性问题。# Q2 e" J! g$ ?3 h! {
目前已有研究报道，ＢＭＳＣｓ经过长期体外的扩增培养后，可以失去其原始的生物学特征，如特异表面标志蛋白的改变，诱导迁移相关蛋白的表达下降或丢失等，这些蛋白表达的改变将影响其特有的损伤反应性和定向迁移能力，进而影响组织再生和修复效率。Ａｂｄａｌｌａｈ等用端粒酶逆转录酶（ｈＴＥＲＴ）转染ＢＭＳＣｓ，经过３年体外培养，观察到所有体外培养细胞株不仅都具有良好的自我复制，还具有多胚层分化潜能。Ｂｕｒｎｓ等研究表明，ＢＭＳＣｓ经过继续的体外培养后可以发生明显的基因改变且是自发的，还可以引起其免疫缺陷肿瘤的形成。在１１０个ＢＭＳＣｓ单细胞克隆中，仅有６株出现了ＩＮＫ４ａ／ＡＲＦ基因位点的缺失和ＤＢＣＣＲ１抑癌基因启动子的高甲基化，使得其基因表现沉默，只会出现在人类肿瘤和骨肉瘤源性细胞株中。研究还发现，实验对长期体外培养的大鼠源性ＢＭＳＣｓ性状稳定性与应用安全性予以研究。首先虽然在细胞形态上ＢＭＳＣｓ经长期培养后出现了不同程度的排列紊乱，折光性明显增强，生长周期明显缩短，但ＤＮＡ倍性并未出现明显改变，所检测的６个表面标志蛋白表达也没有明显差别，提示体外传代培养４０代的ＢＭＳＣｓ尚具备良好的生物学性状稳定性。血清依赖实验主要在于恶性程度较高的细胞系，它不仅可以分泌生长因子，在低营养条件下具有比较低恶度的细胞系或正常细胞系更强的耐受能力，体现出来了更强的增殖活性，还可以作为评价细胞系恶性程度的重要指标。) W" W' P* a, M7 v5 ?8 W
本次研究选用的恶性程度较高的Ｃ６胶质瘤细胞系作为了对照，Ｃ６胶质瘤细胞系表现出了更强的低营养耐受能力，在低营养条件下，ＢＭＳＣｓ无论是早期还是长期培养都较早地出现了生长停滞现象，直到细胞死亡。软琼脂细胞克隆形成实验是一种常用实验方法，在模拟活体内，细胞外基质的半固体生长环境下，进行体外检测评估，分析细胞纯系化集落生长潜力。集落主要指在体外培养基中从一个细胞逐渐增殖而形成的细胞团。肿瘤细胞和类肿瘤细胞的无限繁殖，使得成熟分化细胞不能及时形成集落。４０代的ＢＭＳＣｓ体内移植后尚不存在致瘤性，具备良好的应用安全性。总之，长期体外培养的ＢＭＳＣｓ具有相对稳定的生物学性状和应用安全性，适宜于大数量ＢＭＳＣｓ移植或体外基因修饰为基础的研究展开。
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$ O0 @# U. J" W, V 科学家对类似于肿瘤细胞的增殖特征进行了研究。首先进行大鼠源性ＢＭＳＣｓ的分离及常规培养 用贴壁培养法分离ＢＭＳＣｓ．即将Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ大鼠的双侧股骨和胫骨仔细分离，并剪开其长骨两端的骨皮质，将含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ 培养基抽取到注射器中，通过注射器将培养基反复冲洗该鼠的骨髓腔，收取实验所需的细胞悬液，将其接种到塑料培养皿或者培养瓶中，在３７℃、５％ＣＯ２饱和湿度条件下使用细胞培养箱对其进行培养。等到部分细胞贴壁后对其进行半量换液，第３ｄ实行全量换液，第２代起每３～５ｄ胰酶消化传代，获取长期传代培养细胞。
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流式细胞仪检测不同传代次数ＢＭＳＣｓ表面标志蛋白表达 取第４、２０和４０代ＢＭＳＣｓ单细胞悬液，通过ＦＩＴＣ标记的ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＣＤ９０抗体在室温下避光染色３０ｍｉｎ，使用ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ流式细胞仪和ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ软件（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）进行采样分析。2 X+ J! [1 R2 E! w5 @2 z" s
. r h0 f! H' k9 P; R( b 流式细胞仪检测长期体外培养ＢＭＳＣｓ细胞周期及ＤＮＡ倍性变化 取第４、２０和４０代ＢＭＳＣｓ，使用ＰＢＳ进行离心漂洗，共进行３次，然后使用无水乙醇进行固定，ＲＮａｓｅＡ消化和ＰＩ染色３０ｍｉｎ，最好上流式细胞仪进行分析检测。
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' k; n/ S( O/ ]% g. T6 e 血清依赖实验 取生长状态良好的第４、２０、４０代ＢＭＳＣｓ和Ｃ６胶质瘤细胞分别接种于９６孔板，２４ｈ后将条件培养液换为含０．１％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ条件培养液继续培养；每日取９６孔板培养皿中的８个孔细胞进行苔盼兰染色，使用显微镜对活细胞进行计数取平均值，计算活细胞占所有细胞的百分率；用Ｃ６胶质瘤的细胞作为阳性对照研究。
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2 O& C2 D+ P$ c 细胞克隆形成能力比较 在培养皿孔底预铺置０．７％琼脂，在常规培养箱中过夜凝固；用终浓度为０．３５％低熔点琼脂糖工作液与第４０代ＢＭＳＣｓ和Ｃ６胶质瘤细胞悬液混匀，加入培养皿孔板中，置于细胞培养箱；第二日向每孔中各加入２００μＬ的全培养基，等培养３个星期后，在倒置显微镜下随机抽取培养基的１０个视野进行计数，计数细胞数大于４０的克隆团数需要计算平均值。
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0 Y2 A* ~8 \, N: c9 F0 h, r9 ? 大鼠颅内致瘤试验 取第４０代ＢＭＳＣｓ进行胰酶消化，调节细胞终浓度为１×１０６个细胞／２５μｌ备用；大鼠颅内立体定向注射ＢＭＳＣｓ：在对大鼠腹腔进行麻醉注射时，需要根据其体重采取有针对性的用量，按３．５ｍｌ／ｋｇ的标准使用１０％水和氯醛注射；待对大鼠头部皮毛进行常规消毒后，使用手术刀切开其头皮，使其颅骨充分暴露出来，通过立体定向注射仪对其进行准确定位，定位点控制在其前囟右旁开３．５ｍｍ，同
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; Y# t& @# o) A5 Z8 i8 h 时向前１ｍｍ，使用牙科钻对其进行钻孔后缓慢进针，将进入深度控制为５ｍｍ，注射持续时间为５～１０ｍｉｎ，最后停针３ｍｉｎ后缓慢退针。ＭＲＩ监测颅内成瘤情况，仔细观察该老鼠的生存状态，等到大鼠存活到第２８ｄ将其处死，然后取下其脑切片进行ＨＥ染色。本实验以鼠源性Ｃ６胶质瘤细胞系为阳性对照。统计学方法 选用方差分析、χ２检验。8 I2 s9 Y+ L9 V0 ^6 Y7 _
& ?2 y8 ?9 H8 ], W/ f& J) k 发现大鼠ＢＭＳＣｓ传代培养特征 原代贴壁细胞成分复杂，随着传代次数增加，异种细胞逐渐被淘汰，于第４、５代可获得形态均一、增长旺盛的纯化ＢＭＳＣｓ；这些ＢＭＳＣｓ可稳定培养至２０代左右，以后逐渐表现出传代间隔缩短，细胞增殖速度增快现象，形态学观察细胞排列稍有紊乱，折光性有所增强。3 N! T$ h! v# o. D
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处于合成期（Ｓ期）的细胞比例在体外培养时ＢＭＳＣｓ会随着传代次数增加而逐渐增加。不同传代次数的ＢＭＳＣｓ间ＤＮＡ倍性无明显改变。8 U5 R' u( P6 |- |. |' q
4 e* k5 {% d3 J& i9 v% U 低营养条件下细胞生长情况比较，为在低血清培养条件下所有代次的ＢＭＳＣｓ均在４ｄ内死亡，表明ＢＭＳＣｓ的生长对血清有高度依赖性；但在同样低血清培养条件下，Ｃ６胶质瘤细胞一直存活到第１１ｄ，表现出更强的低营养耐受能力。细胞克隆形成能力比较结果 果显示，接种的Ｃ６胶质瘤细胞系在第２１ｄ时出现了大量的克隆，二者相比较可以看出，所有ＢＭＳＣｓ实验组几乎均未形成克隆。; C& y& i* E5 k. m5 T) `1 |
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体内致瘤性的结果比较 ＢＭＳＣｓ接种的大鼠生存状况均非常良好，ＭＲＩ及脑组织标本中未见肿瘤形成。组织结构ＨＥ染色，在鼠脑切片的ＢＭＳＣｓ移植层面可见较多ＢＭＳＣｓ不均一地分散于正常脑组织结构中，细胞排列无序，胞浆较周围脑组织稍有深染。与ＢＭＳＣｓ接种动物相比较，Ｃ６胶质瘤细胞接种动物经ＭＲＩ检测在第１４ｄ可见接种脑半球巨大肿瘤形成，肿瘤几乎占据整个半球。以上结果显示移植于脑内的ＢＭＳＣｓ在体内可存活较长时间，但尚无恶性转化表现。
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发表于 2015-4-16 14:43
