CRISPR/cas9基因编辑技术成功修复癫痫致病突变基因

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来源：MedSci / 作者： / 2016-01-11' U/ i' T/ Y2 X2 M! h5 c

* D6 I$ K+ y9 R1 p+ W# q2 X& T编码Nav1.1通道α亚基的SCN1A基因发生突变，可导致具有各种临床表型的癫痫，这与通道功能缺失或功能获得的对比效果有关。近期，来自中国科技大学、中科院广州生物医药与健康研究院、广州医科大学第二附属医院和中南大学的研究人员采用基因编辑乳房所以成功修复人类iPSCs细胞中癫痫有关的基因突变。在这项研究中，研究人员将近年来迅猛发展的基因组编辑技术与iPSC来源的模型结合起来，纠正了癫痫患者iPSC中的致病突变。
9 m4 M  P$ H) |, l# F! b6 TSCN1A基因突变，可以导致具有广泛临床表型的癫痫，从相对良性的癫痫到更严重的Dravet综合征。有些癫痫如Dravet综合征，产生了治疗耐药性，其余类型癫痫的治疗，主要依赖于抗癫痫药物。目前市场上有超过20种抗癫痫药物可供使用，它们有不同的作用机制和靶标。关于SCN1A所致的癫痫的机制，我们所了解的信息还很有限，这对于医生选择药物协同控制癫痫发作、同时最大限度地减少不良影响，一直都是具有挑战性的。8 j1 `& d6 h/ P* {. P
在转染系统中异源检测到的癫痫SCN1A突变体，显示出不同的电生理学改变，主要可以分为功能缺失突变和功能获得突变。功能缺失突变更为常见，并与癫痫更严重的临床表现有关。目前存在很多种癫痫的动物模型和患者诱导多能干细胞（iPSC）衍生模型。然而，这些研究对于SCN1A基因有关的任何癫痫的机制，都没有得到深刻的见解。6 |) [( t! _3 A- E, q- }* j8 r
这些动物模型主要使用Nav1.1缺失来模仿功能缺失突变。在小鼠大脑中敲除Nav1.1，可导致小脑和海马体中GABA能神经元中的Nav流和兴奋性降低，但兴奋性海马锥体神经元中没有检测到变化。然后，研究人员发现，选择性删除GABA能神经元中的Nav1.1，足以引起小鼠癫痫，并且，在兴奋性神经元中额外删除Nav1.1，可缓解现有的癫痫症状。& k" S' d+ t0 T; b3 I: S' [# d7 y& I* @- J
Nav1.1删除的动物模型所产生的这些结果表明，GABA能神经元的功能障碍，可能参与了这种疾病的发生。然而，来自患者iPSC衍生模型的研究结果表明，在假定的抑制性和兴奋性神经元中的钠离子增加，与增加的诱发动作电位（AP）和自发放电有关。理解这些看似矛盾的结果是很困难的；特别是当iPSC衍生模型具有一些固有的局限性。iPSCs提供的系统其中一个最严重的问题是，它不能平衡兴奋性和抑制性神经亚型的矛盾，该模型应该特别关注表达Nav1.1的神经元亚型，以确定突变的直接影响，并确定疾病的起源。2 c3 U% e) k, F3 t
癫痫发作，是由于神经抑制与兴奋之间的失衡，包括两种神经亚型以及它们通过突触连接的相互作用。在大脑中，Nav1.1主要在GABA能神经元以及一小部分兴奋性椎体神经元中表达。Nav1.1的这个偏置分布表明，该疾病起源于某一亚型，在疾病过程中有两个亚型以不同的方式参与。显然，现有的iPSC衍生模型不能提供一个包含这两种神经元的系统，同时在电生理学研究中可允许区分不同的亚型，并集中在表达Nav1.1的亚型。此外，iPSC衍生模型是基于不同遗传背景之间的比较，但是据报道，遗传背景能够调节癫痫病的严重程度，这可能会进一步影响到我们对“所观察到的疾病相关差异”的认识。( p! Z1 {& a) W* l# J* Q6 p
在这项研究中，研究人员将CRISPR/Cas9和TALEN介导的基因编辑技术，应用于iPSC为基础的疾病模型，来探讨SCN1A功能性缺失突变所致的癫痫发病机制。通过利用CRISPR/Cas9对iPSC衍生的神经元中的GABA能神经元亚型进行荧光标记，研究人员首次对表达SCN1A的神经亚型进行了电生理学研究，并监测了抑制性和兴奋性类型的突触后活动。# }* X+ q  r, a' z) k
研究人员发现，突变c.a5768G，可导致外源性转染系统中没有Nav1.1流，不仅影响Nav电流量的性质，而且也影响表达Nav1.1的GABA能神经元的Nav激活。Nav的两个变化，进一步减少了幅度，并增强了患者来源的GABA能神经元的动作电位阈值，导致患者来源的神经元网络中的自发性抑制性突触后电流（sIPSCs）减弱。
; m" ^0 A3 @9 v; c( ?( d9 L虽然自发的兴奋性突触后电流（sEPSCs）变化不明显，但是，当进一步分析sIPSCs和sEPSCs的频率之后，研究人员发现，整个突触后活动从抑制为主的状态转化为患者来源的神经元网络的激发态，这表明，仅仅sIPSCs的变化就足以显著逆转自发性突触后活动的兴奋性水平。' s/ E" p* n' p, ]* W! q
总之，这些研究结果填补了我们对于“SCN1A突变对转染外源性细胞的影响和对表达nav1.1的神经元的影响之间的关系”的认识上的空白，并揭示了SCN1A功能缺失突变所致的癫痫发生的根本生理学机制。
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26731440
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