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通过谐调总静电来调节蛋白质功能
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2 X: Y7 P( a9 Z% v3 A+ A; ^Zach Serber and James E. Ferrell, Jr.
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Cell, Vol. 128, 441—444, February 9, 20073 I( [8 @8 G8 R
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依赖于细胞周期蛋白的激酶的活化可以阻止酵母细胞对交配外激素起响应。Strickfaden等人证实这种阻断是由于Ste5的多位点磷酸化。他们的数据提供了一个磷酸化怎样通过总静电使蛋白质功能发生决定性变化的范例，这种功能变化不需要有复杂的构象变化。
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目前有关磷酸化调节蛋白质的思维主要局限在变构调节和构象变化，经典的例子是糖原磷酸化酶。在磷酸化时，糖原磷酸化酶发生重大重组，使底物进入重组前不能进入的催化位点。磷酸化驱动的构象变化常伴随有多个氨基酸残基的重新定位。这些构象变化取决于精确的蛋白质折叠能，因此不能有磷酸位点的突变或删除。
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然而，蛋白质磷酸化的后果也可以更为简单。例如，靠近异柠檬酸脱氢酶活性位点的氨基酸残基的磷酸化可以使酶失活，而不引起任何构象变化。磷酸可以只是阻断底物的结合。磷酸化也能使蛋白质具有另外的功能，而不引起构象改变，例如通过色氨酸的磷酸化可产生SH2结合表位。 `/ d( \9 u0 B6 r' U8 @6 G
3 I2 k$ o- d) P8 x- O% G Ste5是在酵母交配外激素响应中起重要作用的MAPK级联支架蛋白，最近有关Ste5调节的研究为将磷酸化状态变化转换成蛋白质功能变化的一种简单机制，提供了极好的例子。Strickfaden及其同事在本期Cell中展示了靠近Ste5的多聚碱性膜结合结构域的一个保守性很差的SP/TP 8氨基酸残基簇的磷酸化，可阻止Ste5与质膜内层的结合，因而妨碍接受活化信号。这种抑制作用很明显是由于这些磷酸化的氨基酸残基对带负电荷的质膜脂质的静电排斥。通过总静电调节蛋白质功能的想法非常令人感兴趣。这种作用方式与变构作用不同，具有简单、可靠、容易进化的特点。此外，大量磷酸化位点的参与可以形成决定性的、超灵敏的开关，不需要经典的协同作用。
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/ t4 |" w0 r2 N1 \4 w( J# ICln/CDK对Ste5的调节
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9 u1 N! @5 z' a3 s4 @% W, O 当交配外激素与单倍体酵母细胞的G蛋白偶联受体结合时，交配开始。这个过程引起三聚体G蛋白上的Gβγ二聚体释放，随后使Ste5支架蛋白聚集到质膜上。这种聚集促使质膜上的Ste20活化MAPKKK Ste11。损坏Ste5质膜定位的突变会破坏信号传导，而缺少Gβγ时可允许Ste5质膜定位的突变，会导致组成型信号传导。然而，交配外激素途径并不总是对外激素起响应。该途径在G1期细胞中有最大响应，而在细胞决定要进行分裂时，一旦有活化的Cln/CDK和穿越的START，则无响应。相反的情况也会发生。交配途径的活化阻止细胞活化Cln/CDK复合物，并阻止细胞进入S期。9 ^/ z+ j$ S" C+ A; M4 o$ B
, v7 y! t1 [$ v9 @) b 对Ste5是怎样和何时在质膜上定位的研究鉴定出Ste5是一个很重要的Cln/CDK标靶。Winters及其同事发现Ste5的N末端肽在有无外激素时都保持定位于缺少Gβ亚基的酵母质膜上（Gβ亚基通常是Ste5聚集到质膜上所必需的）。Ste5的分子分析揭示了在靠近分配进入质膜的N末端，有一个重要的富赖氨酸—精氨酸片段。Ste5的质膜定位很大程度上依赖于酸性磷酸脂的电荷和密度，这说明静电相互作用很重要。这种N末端的分配对Ste5 N末端肽片段的定位至关重要，但对整个蛋白的定位是不够的。与之类似，在缺少碱性氨基酸区域时，Ste5对受体激活的Gβγ二聚体的亲和力不足以使支架蛋白与质膜结合。+ B: {$ Y ^/ X) O, {* V) j
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Strickfaden等人表明Cln/CDK对Ste5靠近碱性氨基酸区域的多处位点进行磷酸化。这些磷酸化通过排斥质膜内层带负电荷的脂质抑制Ste5的膜结合和外激素信号传导。因此Ste5的反应如同一个AND门或符合计数器，需要由活性Gβγ二聚体提供一种结合能的增加，并由磷酸化的碱性氨基酸区域提供另一种结合能的增加。用谷氨酸置换8个磷酸化位点后产生的Ste5蛋白质对外激素的响应受损，但并非完全被阻断。可能的推测是羧酸只能部分模拟磷酸基团的变构作用，如果再用另一个谷氨酸来置换邻近的脯氨酸，只能使情况更糟。重要的是，用EE置换SP和TP可完全封闭Ste5对外激素的响应。进一步的突变分析揭示了Ste5的质膜结合取决于负电荷的数目，与负电荷的位置无关。因此，在两个相互关联的基本方面，Ste5不同于糖原磷酸化酶。第一，糖原磷酸化酶只需要单个磷酸化便可极大地改变蛋白质的行为，而在Ste5中是由许多磷酸位点分别对抑制起作用。第二，糖原磷酸化酶受变构调节，而Ste5不受变构调节。
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静电开关模型
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4 P7 |7 P6 F) b | Stuart McLaughlin在90年代中期提出一个令人感兴趣的磷酸依赖调节模式，他将此模式称为豆蔻酰静电开关。McLaughlin和其他人表明，碱性多肽可通过库仑引力（尽管很弱）与酸性磷酸脂结合。他进一步观察到MARCKS蛋白含有一组与豆蔻酰结合的碱性氨基酸残基，可提供足够的结合能，使蛋白质固定在质膜上。在该碱性氨基酸区域中藏有3个磷酸化位点，当这些位点磷酸化时，MARCKS脱离质膜。用Src的豆蔻酰化碱性氨基酸N末端和一对磷酸化位点进行的类似研究得到相同结果。McLaughlin发现，“随着质膜中酸性脂的百分比增大、肽中碱性氨基酸残基数目的增大以及离子强度的减弱，质膜结合有所增加，与碱性氨基酸残基和酸性脂的化学性质无关。”这些观察明显说明质膜结合是由于非专一性静电吸引作用，磷酸化可通过减少肽的净正电荷而减少亲和力。; k, R- K/ I. W
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中等大分子相互作用的净结合自由能(kd = 1 μM)是8.3 kcal/mol。McLaughlin的生物物理测定表明，每个磷酸化使平衡常数(Keq)降低10个系数，相当于1.4 Kcal的ΔG。因为额外的两个负电荷产生的静电排斥力与大多数有生物学意义的结合能相比很小，所以需要有几个磷酸化位点的累计影响才能完全破坏相互作用。除了磷酸位点的位置和一级结构，如果该位点很接近聚碱性氨基酸区域，则相对无关紧要，这种位点相对较容易产生。* S z: Y( i7 v9 Y
0 K T/ I& C6 b: p* i 在Ste5与质膜结合的调节中，明显有McLaughlin模型的基本特征。对于Ste5来说，豆蔻酰化的作用是通过与受体激活的Gβγ二聚体的蛋白质—蛋白质弱相互作用来完成的。Ste5的多位点磷酸化先是减弱Ste5与质膜的结合，然后使这种结合逆转。如果使用McLaughlin的数据，每个Ste5磷酸化减少约1.4 Kcal/mol的结合能。
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开关或可变电阻？8 c7 E2 ]+ c5 G3 G
" N$ L a& V5 @ 本文推测的Ste5的调节与Sic1（得到深入研究的CDK定量抑制剂）的调节显然有可比性。这两种蛋白质在多个保守性很差的位点因CDK的磷酸化而导致活性被抑制。此外，Ste5和Sic1都处于双重负反馈环中：Ste5通过Far1抑制CDK的活化，CDK通过磷酸化阻止Ste5的定位。Sic1定量抑制CDK，CDK通过启动Sic1的降解抑制Sic1。这些系统使细胞能在两种交互排斥的状态之间触发。如果双重负反馈环中的任何一个反馈对其上游抑制剂有类似开关的S形超灵敏响应，这种双稳定系统是最容易产生的。在多亚基协同酶中可通过变构效应产生S形响应。对定量产生这种S形响应来说，多位点磷酸化和总静电可能是更简单的方式。9 h$ Z& c9 Y7 X
! s: o5 j# C+ G6 m1 M" z 在Ste5和Ets1之间也有平行关系。Ets1是转录因子，其DNA结合位点受成簇的3个CAMK1磷酸化位点的调节。Ets1中的每个磷酸化可相继降低Ett1对DNA的亲和力（约下降0.4 Kcal/mol），但低于McLaughlin的测定，也低于本文估计的Ste5亲和力的下降。通过在磷酸化簇和ETS DNA结合结构域之间的总静电相互作用，使Ets1从自动抑制状态转换到DNA结合状态，可造成上述亲和力的下降。但是在这种情况中，Ets1的调节类似于可变电阻，而不是开关。还有另外一些例子。例如，Kv2.1钾通道的多位点磷酸化可造成逐渐叠加的通道性质变化。这是一个难题。是否多位点磷酸化和总静电在某些情况中产生渐进式响应，而在另一些情况中产生开关式响应？如果确实如此，什么决定响应的定量特性？
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, e2 S& U6 |+ i+ t 为了回答上述问题，我们启用了Ste5在8个位点的简单磷酸化和脱磷酸化动力学模型。类似这样的系统只有在最后面几个位点比最前面几个位点更容易磷酸化时，才能对活性CDK的浓度产生类似开关的超灵敏响应。这种要求类似于多亚基变构酶协同作用概念。Ste5在最前面几个位点的磷酸化是否可促进它最后几个位点的磷酸化？
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% o* | _- m& X; V* q 根据简单组合学，我们猜测在无质膜结合时，Ste5不会发生上述情况。有8种方式可将Ste5-0P转换成Ste5-1P，但只有一种方式可将Ste5-7P转换成Ste5-8P，这样才能给其他事情均等机会。我们认为第一个磷酸化的有效速度常数是第八个磷酸化的有效速度常数的8倍。随着磷酸化的增加，磷酸化速度常数相继变小，而脱磷酸化速度常数相继变大，结果使磷酸化成为激酶浓度的级差很大的函数。在这种情况中，磷酸化是一个可变电阻。
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- A! d7 k5 h' m f, o. j! ?4 n5 G 然而，Ste5与质膜结合可引起极大的变化。如果假定只有自由Ste5能够被磷酸化和脱磷酸化，质膜结合可遮蔽Ste5的Cln/CDK磷酸化位点并遮蔽相关的磷酸酶，则随着结合到Ste5上的每个磷酸，会持续有越来越多的自由Ste5供磷酸化。磷酸化以这种方式促成更多的磷酸化，其结果是一种非常类似开关的响应。系统从大部分为低磷酸化的Ste5转换成大部分为高磷酸化的Ste5。这种转换可在相对较小的激酶浓度范围中进行。( h* b( x0 G5 o: o6 ?: g
# p6 ~; B2 _- w& n 响应会有某些额外的加速，这是因为结合常数对结合能的指数依赖性。例如，Ste5的磷酸化状态从4磷酸变换成5磷酸只增加1.25倍的磷酸化，但可使质膜结合常数有10倍的改变。这进一步加强响应。只要相关的磷酸化位点数目不比8小太多，Ste5的质膜结合可有很高的Hill系数，每个磷酸化引起的结合常数的变化接近10倍。
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$ N9 o% b8 |$ V( X0 m. y 是否Ets1在结合能方面是个可变电阻，而在结合常数方面是个开关？也许不是这样。总静电产生的超灵敏性的程度取决于每个磷酸化产生的（或除去的）结合能的量，也取决于磷酸化位点的数目。按照测定的Ets1的磷酸化位点数目（3）和结合能的量(0.4 Kcal/mol)推断，Ets1蛋白的反应类似可变电阻，而不是开关。
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- C8 h- K7 `8 }进化可塑性
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磷酸化位点常常存在于蛋白质中不形成高级结构的区域，这些区域的保守性通常很差。这些观察与磷酸化的变构模型不一致，但是与使用总静电的机制吻合。尽管在棉花和克鲁维乳酸酵母中的Ste5同源物与酿酒酵母Ste5的同一性少于30%，但是在一个保守的碱性—碱性—W—T—E基序中的螺旋盘揭示了它们有基本的疏水面。在上述三种Ste5蛋白中，碱性氨基酸片段两侧的区域都含有一个冗余的SP和TP基序。这些序列的位置有很大不同，说明位置相对不重要。理论上在这些多磷酸化蛋白质中，对于激酶的结合亲和力和响应协同性可直接受磷酸位点的产生或消失的精细调节。
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/ g- {) Y# y) n8 @) e# N8 U$ Z9 g2 { 由于对磷酸位点的空间位置没有严格要求，这使多种上游激酶进行叠加调节成为可能。David Morgan的研究小组最近揭示了尽管激酶Ime2和Cdk1有不同的最佳底物专一性，但它们都可磷酸化一组重叠的底物。例如，Cdh1有11个共同CDK位点，另外还有5个共同Ime2位点，每种激酶的磷酸化都可抑制Cdh1活化APC的能力。对多个空间分散的磷酸位点的依赖表明这是一个类似静电开关的机制。
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3 C; z, F* P1 W3 Q+ C# G! A 最近我们的研究小组研究了多位点磷酸化对细胞周期的重要调节子Wee1的控制。Wee1与Ste5类似，在几个保守性很差的CDK位点上磷酸化。在这种情况中，这些位点明显没有静电开关的功能，而是减缓Cdk1的活性，通过竞争机制产生超灵敏性。和静电模型一样，在这种竞争模型中，磷酸化位点周围的结构和局部序列不需要严格限定。
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# q& h" M5 w0 J( H结束语
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在过去一些年中，Ste5为蛋白质调节领域提供了大量重要的线索，为我们有关信号传导支架、定位结构域和执行邻近区域的概念做出了贡献。这些概念全部适用于各种信号传导途径。现在Ste5又为如何通过总静电影响使多位点磷酸化产生强大的生物化学开关提供了极好的范例。在翻译后进行谐调的总静电为蛋白质功能调节提供了一种能代替变构作用的简单有效方式。我们认为它也会被证明是一种蛋白质调节的循环方式。
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本文转自建人先生原创，感谢 |
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发表于 2009-4-28 21:21
发表于 2015-6-19 13:34
