电子科技大学开发基于 CRISPR-Cpf1 核酸酶的高效植物基因组定向修饰新系统

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1 P: h5 n9 X, @+ v4 ~8 Q. M$ d( ANature Plants：电子科技大学开发基于 CRISPR-Cpf1 核酸酶的高效植物基因组定向修饰新系统
( t$ z' j/ H' C2 V9 l5 Q2 C1 [来源:电子科技大学 / 作者:Planta216 / 2017-02-20
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+ n- K0 {, n/ Y1 m, P' o专题聚焦： 基因编辑的“中国元年”
; O! U- F1 E* V" g% Q6 V' \大牛聚首： 3月24日上海-基因编辑学术研讨会
  \% U+ k- A0 f  r/ O( Q0 u2017 年 02 月 17 日，电子科技大学张勇教授课题组、美国马里兰大学 Yiping Qi 博士课题组合作在《Nature Plants》上发表了题为《A CRISPR–Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants》的研究论文。该工作基于新发现的 CRISPR-Cpf1 核酸酶（一类有别于 CRISPR-Cas9 的 II 型 CRISPR-Cas 系统）开发了一种简单、高效、特异的水稻（植物）基因组定向修饰新系统，对 CRISPR-Cpf1 核酸酶在植物基因组定向修饰中的应用效率、作用特点等关键问题进行了有效解读，为植物基因组定向修饰提供有又一利器，为 CRISPR–Cpf1 定向修饰核酸酶系统在植物功能基因组研究及育种实践中的有效应用作出了重要贡献。: c: k3 i+ b8 R* Q' t2 m3 k
自 2012、2013 年，研究者先后证实了 CRISPR-Cas9 核酸酶在体外及体内的序列特异性剪切活性后（Jinek et al., 2012; Cong et al., 2013; Mali et al., 2013），作为有力的定向修饰核酸酶工具，CRISPR-Cas9 系统多次被 Science 评为“Breakthrough of the Year”，被广泛应用于动、植物及微生物的基因功能解析、新种质创制、基因治疗等基础研究及应用实践工作中。尽管 CRISPR-Cas9 编辑方法现实了简单、高效的特点，也被认为是遗传研究领域的革命性技术，但研究者依然没有放弃 CRISPR 系统的改进及拓展工作，希望能够实现更简单、更精准的目标基因组定向修饰。
& w# j; O! L0 @8 B2015 年 Cell 的一项报道中，研究者发现了一种新的能够在单一 crRNA 引导下实现人源细胞内源 DNA 定向剪切的 II 型 CRISPR 系统新成员：CRISPR-Cpf1。相较 CRISPR-Cas9，CRISPR-Cpf1 有以下 4 点优势：1）、Cpf1 蛋白比标准的 SpCas9 蛋白要小，且 CRISPR-Cpf1 剪切 DNA 仅需要 1 个 crRNA 分子；2）、CRISPR-Cpf1 是粘性末端剪切方式，可以让 DNA 插入更可控；3）、CRISPR-Cpf1 和 CRISPR-Cas9 识别 DNA 底物上的 PAM 位点不同（CRISPR-Cpf1 识别 5’-TTTN-3’的 PAM 位点），拓宽了 CRISPR 编辑位点设计的选择性，可能具备潜在的 “A/T”富集区偏好性剪切活性；4）、CRISPR-Cpf1 切割位点在 PAM 位点的 3’远端，使得编辑结果有了更多变化。已有的证据表明，CRISPR-Cpf1 可应用于人源细胞及小鼠基因组定向修饰，显示其具有广泛应用前景，但 CRISPR-Cpf1 是否可以有效在植物基因组定向修饰中发挥有效功能，还需要切实的实验证据及有效的应用系统。5 C! U) o: e' z5 j
电子科技大学张勇教授领导的植物基因组工程实验室基于前期构建的高效 CRISPR-Cas9 单一转录单元（single transcript unit CRISPR-Cas9，STU-Cas9）定向修饰系统（Tang et al., 2016）基础上，针对 CRISPR-Cpf1 的核酸酶蛋白及向导 RNA 的表达特性，构建了 Pol II 型启动子融合核酶（ribozyme）驱动的 Cpf1 蛋白、crRNA 植物表达单元，针对水稻内源基因 OsPDS、OsDEP1 和 OsROC5 实现了有效定向修饰（Tang et al., 2017）。他们在研究中对比测试了之前人源细胞中报道的 2 种 CRISPR-Cpf1 核酸酶在植物细胞中的适用性，发现尽管 2 种 CRISPR-Cpf1 核酸酶都显示了进行植物定向修饰的能力，但 LbCpf1 的定向修饰活性显著优于 AsCpf1。进一步的高通量测序分析揭示了基于 CRISPR-Cpf1 核酸酶的植物基因组定向修饰的 3 个主要特征：1）水稻 NHEJ 定向修饰类型主要以 6 -13bp 的多碱基缺失为主（CRISPR-Cas9 介导的 NHEJ 定向修饰类型主要为 1bp 的单碱基缺失或插入）；2）CRISPR-Cpf1 核酸酶介导的植物目标基因组序列高频定向修饰位点位于 5’-TTTN-3’PAM 位点远端 13-22bp 的位置；3）CRISPR-Cpf1 核酸酶具备良好的序列特异性定向修饰活性。随后，在水稻稳定转化试验中，CRISPR-Cpf1 核酸酶显示了惊人的高效定向修饰活性：在测试的 3 个水稻内源基因的 6 个 CRISPR-Cpf1 核酸酶编辑位点中，T0 再生植株的定向修饰效率均达到 100%，且几乎所有定向修饰类型都为双等位突变。除了定向剪切能力外，论文还报道了基于 CRISPR-Cpf1 系统的目的基因定向转录抑制能力。2 M, [* j" E" U7 V/ Y) }& K
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图 1 高效 CRISPR-Cpf1 新定向修饰系统构建、活性验证及定向修饰（A： CRISPR-Cpf1 构建及原理示意图；B：基于高通量测序的 CRISPR-Cpf1 定向修饰活性检测；C：基于 CRISPR-Cpf1 的目标基因定向修饰再生植株统计；D-F：基于 CRISPR-Cpf1 定向修饰系统的分子及表型检测）.（图片修订自：Tang et al., 2017, Nature Plants）
) }! d) Q" L, D) A论文通讯作者为电子科技大学张勇教授、马里兰大学 Yiping Qi 博士，电子科技大学生命科学与技术学院博士生唐旭、东卡莱罗纳州立大学博士后 Levi G. Lowder 为论文共同第一作者。该工作得到了国家自然科学基金、国家转基因重大专项、北卡罗来纳生物技术中心 - 先正达协同项目和美国国家自然科学基金的资助。
: t: C5 N; U- Y+ [- W% O$ k$ x! }论文：A CRISPR–Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants
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