大鼠全骨髓培养法为何看不到细胞贴壁??培养液也不见混浊和变色

bimuyu

MSCs应该属于成纤维样细胞，初次接种培养时其贴壁过程快于上皮样细胞，在消化过程中其先脱壁，而上皮样细胞则要消化相当长的时间才脱壁，因此可以利用这一点加以纯化BMSC，另外消化时间也与细胞种类和消化温度有关，大鼠的37度2－3分钟足够了，但是兔子的要37度5分钟左右。

bimuyu

我的一点心得：
3 a" Z4 a+ f/ l3 ?1、大鼠应选周龄较小为好，2－3W；
8 x2 j! Y: @. a- W3 X7 C7 f2、全骨髓贴壁法，一只大鼠的骨髓接种两瓶（25CM）；( v* G+ y0 q4 x1 L3 @4 Y& U* E5 [" O
3、血清用10％；
+ N/ X$ c# U, `; t5 g  R4 [4、原代培养前三天不需要观察，第四天再观察；换液可全量换液；细胞长满80％即可传代，1：3－4传；
  O5 j  z# w$ J- X& f5、消化传代时，加入胰酶后见细胞突出回缩，立即竖起瓶子，加入含10％血清培养基终止消化，之后轻柔吹打；新买的胰酶消化细胞，前后约1分钟就可以。
+ m, D% _0 l: d* ]( T/ q9 f6、杂质细胞会随传代而减少，但如果用国产血清，传导第6、7代，细胞的形态就会发生改变，有可能变异了。
' _5 h& {" w% w7 F1 X一下是我的原代细胞，第5天，大家相互学习，请指教！ : f/ C9 j% m  ]

bimuyu

细胞接种时的密度要考虑一下，另外3天可半量换液。

bimuyu

我认为在全骨髓贴壁法原代培养传代时最好不要等到80％融合，因为接种时虽然尽量混匀但是MSC仍分布不均，因此可能有的局部细胞长得很密了，而有的部位却很少，等到80％融合时很多细胞已经有生长的接触抑制现象了，因此建议原代传代要早，我的经验8天左右较好。另外，传代比例不要太高，最好按照消化下来的细胞密度计算，以10^4/cm2较好，密度太低p1代细胞生长会需要很长时间才能融合。尤其是大鼠细胞，很可能在p1代就发生形态改变了。

bimuyu

我看到了你的MSCs照片，你用全骨髓贴壁法分离细胞，第四天换液，根据我的经验，第5天时杂细胞一般还是比较多，细胞的密度比较稀，并且原代细胞的分布不太均一，有的地方稀稀拉拉，有的地方成团，要到14天左右才传代。你的MSCs在第5天就这么纯，细胞密度这么高，你是不是在第7天左右就可以传代？是不是你的原代MSCs不用经过生长潜伏期？请多多指教！

bimuyu

楼主所说的，我也同时养了人胚胎和成人骨髓基质细胞，后者贴壁较快，约5天可见到梭形、多角形细胞，可前者始终未见贴壁，起初我还考虑是胎儿的细胞增殖周期长的缘故，可三周过去了，仍不见动静。这两种细胞我都用的低糖DMEM培养基，10%FBS。所以我认为还是取材过程中出现问题的可能性比较大，有可能我们取得细胞里面根本不含有贴壁生长特性的细胞，要不一样的培养条件为什么成人的很快贴壁而胎儿的始终未见贴壁呢。你具体采用什么方法取得骨髓，是用肝素盐水冲出来的吗，冲得干净吗？

bimuyu

我有同感，成人的MSCs贴壁快，生长好，但胎儿的生长非常慢，很容易失败。建议原代培养时可将FBS调到20%。

bimuyu

那养胎儿的MSC除加大FBS浓度以外，取材是不也很容易出现问题，怎么样取材更合适呢？

bimuyu

我养过SD大鼠的MSCs，经过摸索，有以下几点需要注意：' Y! z3 m8 L) p9 N
1、选择周龄较小的大鼠；; @  G" N/ b2 V. U2 R. O! P# y) ]
2、高密度接种，一般25m的接种一瓶。有一段时间我接种到六孔板，每只两孔。当时效果不错，并且随着传代，细胞简直是疯长；3 V7 R1 g2 }& z  A& S& V6 b
3、选择质量好的血清及培养液，血清我用的是Hyclone或者Gibico，培养液是Gibico；) R* G" @$ t$ H$ q
4、首次换液可选择半量换液；3 f* y) @0 T8 E8 x. U

) |/ L5 l) s5 z( m7 F" x$ D以上只是经验之谈，因为我主要是培养猴子细胞，目前手头的也只是猴MSC的图片，有需要的话我可以贴出来。

bimuyu

我现在刚开始试着养Rhesus 的MSC, 原代细胞长的很好， 可传一代就出现多核现象， 细胞状态也很不好， 能分享一下经验吗？
* I* H2 U7 D% f6 c/ w4 ]1， 是否也和猴子的年龄有关， 是越小的越好吗
/ k0 V- X' n2 ]" t% ^! v0 q4 a2， 可能与猴子感染某种病毒有关吗
: M' Z% D+ ~( S( F/ s5 M  C( l$ @: }$ D1 g( ?; [, ^2 m
我用的giboco的IMDM 和Hyclone的血清