人脐血间充质干细胞讨论区

slau

不好意思啊，这些天很忙就没上来看了。9 \9 y; _, b  H/ j, z3 o& n! M$ `
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很多情况下细胞发生老化可能是由于营养不足或培养液成分不够好而引起的。因为脐血间充质干细胞的原代培养时间很长，长达一个月左右，在这个生长过程中很容易受到外界环境的影响而发生分化或老化，所以在培养液方面就有很高的要求。不知道你用的是什么培养基，我用的是Mesencult TM培养液。从培养开始以前就要对培养液和血清进行分装，每次分成约50ml，这是考虑到每次换液需要培养液不多，而在抗生素加入后最好一周内使用；而且还有培养液内L-谷氨酰胺容易分解，要求在混和血清后一个月内使用。看看是否能做到用前分装，因为如果一开始就把要加药物的都加了，混合成一大瓶培养液，可能在一开始养细胞的时候细胞状态会很好，但是到了后面该分解的分解了，而培养液是否无菌就很更难保证了（因为开启次数很多）。这是偶之前失败过后总结的宝贵经验！！！
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再一个是关于细胞生长速度的问题：在一开始如果接种的细胞密度够大，后面出现细胞克隆单位数就会增多。细胞的生长速度开始会较慢，后来就会加快，特别是后面一个星期，细胞会越来越密集。
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% p1 A; |: D+ \' D$ v在原代的培养过程中会有细胞出现分化或老化，特别是在克隆形成单位的周边。细胞最容易分化形成神经元（即使是在没有诱导剂的情况下，也会自然发生分化），后者具有树突和轴突，有时还可见到轴丘。老化的细胞比一般的细胞大，形态不规则，胞质中出现空泡。这些分化或老化的细胞在原代中数量较少，可通过传代筛除。

slau

有人用高糖，也有用低糖的，20％血清浓度会太高，易使细胞发生老化，15％就可以了。
5 A& m8 Z& ~; {7 X另外，如果注意无菌操作的话，不加双抗生素也行；如果不放心，也可以加，对贴壁和生长影响不大。

slau

我也按文献说的做了　养了好几拨了　到现在什么都没有　什么２０％啊，１０％啊，２０００转啊，１５００转啊，都试了，还是不行．
  Z4 L, X- {8 a7 z/ ~我就纳闷了　发表文献的人是不是在编的啊，还误导大家．

slau

不知道你用的是什么分离方法。但是我觉得，任何一种分离方法都不可能达到完全去除红细胞，最后得到的细胞里面总会有些红细胞的。少量红细胞是允许的，不过太多了确实会影响MNC的贴壁（这个“太多了”具体的量不好回答，没有数据资料）。有的文献用的是自然沉降法，即加入高分子量的聚合物（如明胶、羟乙基淀粉、甲基纤维素等）使红细胞聚集沉降，然后取上清离心制成悬液就直接接种了，在这种情况下，也没有经过淋巴细胞的分离，会有较多的红细胞夹杂在里面的，另外还会有血小板，但是还是有单核细胞贴壁了，并且产生克隆。自然沉降法与Ficoll分离法相比，MNC回收率是上升了，不过活细胞比率稍低。, Y1 [6 v; v0 h2 C- |) W
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分离后还是有很多红细胞可能有以下几个原因（以Ficoll密度梯度离心法为例叙述。个人经验，仅供参考）：
* z$ f9 m% Q, S8 q' D1、红细胞沉降时间短了。一般需要30～60min，具体要看液面形成情况以及上清的颜色而定。
+ o. K- m) X* N. `+ M( N. B2、取上清时不小心打乱了液平面。此时需要重新沉降。
5 _0 X8 H+ l' v3、将细胞悬液加入Ficoll上时速度快了。要沿管壁慢慢加入细胞悬液，不能打乱Ficoll的液平面，这一步往往很关键，直接影响分离效果。
: j) N/ c4 |4 y4 x" c) n) J4、取MNC层吸取的液体多了。取MNC时要做到尽量多地取中间的白膜层，又要避免吸取过多的Ficoll液。4 c1 I2 J; f8 x* @! M2 O

% f7 U3 J5 t) z) k目前MNC分离方法较多，较常用的是用明胶沉降红细胞，再经过Ficoll分离液分离，这种方法效果很好。

slau

xcchao5855 wrote:
! y* @+ n' G# ~* S" h2 o6 X% ^请教ven15和hardtc，用柠檬酸钠抗凝可以吗？有没有体会，最少需要多少脐血才够培养出一批MSC？培养体系中的bFGF是必需的吗？有没有人尝试过用CD133等磁珠分选后培养，是不是情况更好些呢？$ I& Z5 c  i2 l/ K/ f  }3 u
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; t0 K5 r' L% Y6 ^( j; v8 W* D: e/ B1、可以用柠檬酸钠，不过要注意最终浓度
% T- d3 x( n4 K: E6 f( c# P. ?2、脐血量50～100ml，胎龄越大，需要的脐血量越大* @1 q8 r* j: N; W
3、对于一般的培养基可以添加bFGF，可促进生长，如果是用的stem cell公司的专用培养基则不用添加
: M7 z" E; [' i, J4、磁珠分选比较理想，不过价格昂贵，不能广泛使用& [* e; P5 t) I9 d: D1 X8 L% x
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  V6 D1 v, e, ]2 U0 J医坛小媛 wrote:6 u# k# A3 d7 ?
请问hardtc 战友，您这用的明胶是明胶溶液吧，需要新鲜配置和消毒吗？大概要沉降多长时间呢？
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新鲜配制3％明胶溶液，高温高压消毒，沉降RBC60min左右。: S; q) S+ G  u

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' N8 A2 c6 I6 S2 q8 J8 c- f- ?8 {xujunjunyls wrote:" }# \9 f4 ]" E; r! X6 h1 @
谢谢你的贴子 hardtc 天山玉玲珑 ,我用的是D/F12培养基,感觉细胞老化的很快,很容易死亡,请问你添加了那些因子,其中的含量是多少.另外培养液的选择是否很重要,国外文献有用IMDM.
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" o2 F4 D! X- b4 t- b0 W. r有文献记载，比较了几种培养基，发现商品化的间充质干细胞的培养基Mesencult TM效果最好，其它的也可以培养出来，只不过成功率低些而已+ W" n- J2 m1 p3 g
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* j: U6 x: D+ c6 l3 e/ Q粘豆包 wrote:' I. o4 E! `7 g( w! z* e/ Y
胎盘里面的msc丰富么？？？？0 i( ^( Z) B2 O0 c1 M4 D

6 f6 {, H. I0 x6 ~+ c5 \+ p; Y# H# t: v- T3 x1 }2 @
也有人做过脐血以外胎盘或脐带来源的MSC，认为胎盘、脐带或脐静脉壁来源的MSC更为丰富，不过做这方面研究的人不是很多。

slau

xcchao5855 wrote:
9 {& U6 H; z" I9 m) Z, R# Z非常感谢hardtc，因为我要找人帮忙取脐血，所以取那么大的量好象有些麻烦，想再次请教，20ml脐血能分离出多少MNC？是否足够接种一个25cm2的flask?/ r, O4 `  F* V( Q
我也曾考虑用Mesencult TM，但那也很昂贵啊，不知你用得是否便宜，从哪家公司定的货？) Z& \9 x) c/ B/ l+ m4 D! m* j

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6 |, K$ \3 F+ N( A) u! }找会抽血的护士帮忙就可以了，用50ml的注射器抽，可以抽得到的。50ml 的脐血可以分离到约1×108个或更多，够一个25方flask的，20ml血的话密度稍微低些，效果不够好，可改用培养板。
+ Y; a# H8 [. V7 f* h2 P9 e9 b; hMesencult TM大概2500一套，共500ml，我在长沙买的stem cell公司的产品，一般大型的试剂公司都可以订到。
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decemberose wrote:0 T, U' W7 b2 L0 t2 B6 G
......我的细胞怎么总也不贴壁,是因为我用15ml脐血太少了吗？5 O0 {, W, s& \0 W& R* K& C

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$ k( g. B9 o; @1 E$ Q' E$ H15ml血太少了，如果你取的是早产儿的脐血的话还值得试试，如果是足月产的话也要50ml以上的。

slau

用什么方法分离的？？？* ^' Q4 Z5 M1 P9 I. j9 R& R
我用的是ficoll分离液法。: q* @$ ]8 Q; N( u! a
养了三个月了，一无所获
" i& x, m( ?+ Z( |2 T只有一次养出了成纤维样细胞， 可是两周后成纤维样细胞越来越少，破骨样细胞多了
' K& n1 d: W( y; B  G有文献说培养基要偏酸性
5 j. z! {+ G) B. z2 N/ c. O有文献说要stemcelll公司的msc 专用培养基messcult TM

slau

分离方法大体有：, o6 P5 o4 D! u# H9 U3 n* d
1 ficooll法
0 _$ a/ N: n8 |) d9 _2 羟乙基淀粉沉淀 （明胶沉淀 甲基纤维素沉淀 右旋糖酐沉淀）1 b2 a0 z9 W, u" W' O5 }! U
3 羟乙基淀粉沉淀 （明胶沉淀 甲基纤维素沉淀 右旋糖酐沉淀）之后再
/ Q2 Y! E8 c8 D! |0 R" v) N# sficooll法

烂桃

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原代可以用85%α-MEM+15%HS