你的细胞还活着吗？

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你的细胞还活着吗？7 I3 p7 d; _6 v( @2 E2 a
来源：本站原创 2018-10-19 17:427 n6 B: T; x. E% y/ z& h
忙碌中的实验室，5 ~9 G# `( D5 D: n6 |5 \
用什么来证明我坚强的活着？: o' _3 U+ ]$ H& f# u, ]
开组会呀！
. M8 u" c: ^( m0 x: s+ O6 C& t4 \ 气氛紧张的组会，
/ L7 R! {3 N6 L. w, A- i用什么来证明做过检测的细胞还在好好的活着？
8 L5 z1 g' F7 B找Merck呀！ 4 [0 ?: P! J1 _" @7 j2 `7 _7 g
PCR、抗体IHC染色等细胞分析方法由于只能反映某个时间点的细胞行为而具有局限性。当传统细胞分析方法无法获得预期结果时，使用实时细胞分析方法通常会得到很多新的生物学发现，因此活细胞分析技术在科研过程中发挥着越来越关键的作用。
' r' Z7 \7 V' E9 m6 W/ T4 ~为了研究单个细胞的行为、生长和分化、细胞间互作等,可以在不影响细胞形态和功能的前提下永久标记细胞群体是至关重要的。常用的细胞标记方法包括：荧光细胞追踪染料、慢病毒生物传感器和荧光探针等。" M! _! k4 {% {5 Y% p$ S) C  p
荧光追踪染料
. ]2 E$ h/ [' u$ h% w# F& y荧光细胞追踪染料,结合流式和图像细胞计数是非常强大的工具，可用于体内和体外研究不同细胞类型的互作和命运。尽管有成千上万已发表文献在使用这些染料，但使用最广泛的细胞示踪应用包括监控：1)干细胞和祖细胞静止、增殖和/或分化；2)抗原驱动的膜传递和/或前体细胞增殖；3)免疫调控和效应细胞功能。) q4 i, _7 i( ]* a' Q
商品化的细胞追踪染料因其化学和荧光性质不同具有非常广泛的类型，但绝大多数可基于细胞标记机理分为两类：“膜染料”（典型代表：PKH26）是高度亲脂性的染料，稳定但非共价地插入细胞膜；“蛋白染料”（典型代表：CFSE）是氨基酸反应性染料，与细胞蛋白形成稳定的共价键。
5 y. `6 s1 u2 B& r$ w3 W  j+ \1 P细胞追踪试剂特性比较
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) p5 C9 g4 B! A) A' n3 W缩略词： Dil = 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate; DiO = 3,3’-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate; CFSE = carboxyfluorescein succinimidyl ester; Biotin-SE = biotin-succinimidyl ester; GFP = green fluorescent protein; b-Gal = b-galactosidase4 L3 U# T1 Y+ N  U6 k4 X
PKH/CellVue®活细胞标记试剂盒
5 O* g  x7 ^* x2 P  ~5 X技术原理：
0 `: m7 A) @" ^% w  U' K+ {PKH和CellVue® Fluorescent Cell Linker Kits荧光细胞标记试剂盒可为活细胞提供长久的荧光标记，且无明显的毒副作用。该试剂盒采用专利的创新细胞标记技术，强烈的荧光染料附着在长的亲脂性尾上，在短期的常规膜染色过程中（1-5分钟），亲脂性尾扩散入细胞膜，荧光部分暴露在细胞的外表面附近。由于该标记技术不具有特异性，因此可广泛应用于多种细胞类型，包括动物细胞、植物细胞以及其他含粒子的膜。7 T$ ~( z8 F3 G6 g
技术特点：
; w# D0 W+ v; ^3 V) Z+ T5 A, A. 活细胞标记：标记细胞膜，可在体内和体外对标记细胞进行实时观察和跟踪2 q& Q1 M. z% h' {5 G
. 无毒副作用：标记物质对细胞无毒性，不影响细胞的形态、生理进程、增殖活力
* c* [/ B# K2 d# c" k( w/ }. 荧光稳定持久：荧光强烈易操作，无明显染料渗漏或细胞间转移，荧光染料在体内活细胞上的半衰期长达100天5 F  H7 B) J* y6 A5 k- o& b  @) H2 b
. 数据稳定：细胞标记统一、数据可重复性强
+ @7 I6 M1 Y% A' \# j# {& i5 l. 应用广泛：可标记真核细胞和细胞系、细菌和寄生生物，不同染料可实现多色分析，且与其他荧光标记兼容- c! X0 t9 }' i
. 久经验证：经过多种细胞类型和应用验证，已发表文献近万篇* l  V/ y9 l7 D5 ^. S/ C. r0 g6 Z

- g# `+ z% z% h7 A: v默克目前可提供3种颜色标记，其中PKH67是激发（490 nm）和发射（504 nm）波长类似于荧光素的绿色荧光，体内半衰期10-12天；PKH26是红色荧光，其激发（551 nm）和发射（567 nm）波长特征与丹明或藻红蛋白检测体系相容，同时也能被氩离子激光器发射的488 nm波长激发。PKH26在体内的半衰期超过100天，是理想的进行细胞增殖研究和其他长期实验的体内细胞追踪试剂。CellVue® Claret是一种在生理学范围不受pH影响的远红外荧光染料，其激发（655 nm）和发射（675 nm）波长特征与红光半导体激光器相容。该等交联剂生理学稳定，对细胞体系几乎无毒副作用。标记的细胞仍可保持生物学特性和增殖活性，是细胞示踪和细胞间相互作用研究的理想选择。6 W0 v  I9 P. i0 Q. ?6 @
技术应用：% N& e0 c1 U2 W! p, ~3 K. M7 x
由于标记染料不具有特异性，PKH/CellVue®活细胞标记技术可用于多种类型的细胞和生物，目前已成功应用的细胞和生物类型，以及体内和体内应用如下：
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- h! R- F( z7 F. Q$ L/ C. f3 t* ^应用举例：3 w- E% N7 C. J$ s; |  E0 ]
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共聚焦检测单核细胞来源的巨噬细胞对恶性淋巴细胞的吞噬作用。巨噬细胞(FITC标记为绿色)、恶性淋巴细胞(PKH26标记为红色)和双特异性抗体在37°C孵育30、60和360分钟后检测，图像显示目标结合、摄入和破坏的过程。
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3 B! G$ T& x9 V共聚焦图片：PKH26标记的杜氏利什曼虫显示膜表面和鞭毛储存室（红色），核内表达GFP（绿色）。. j$ T0 `- c! {' c
位于鞭毛基部的高度标记的鞭毛储存室是一个仅由细胞膜组成的三维结构，是这些寄生原生动物体内的胞吞和胞吐作用的位点。
0 E, o4 m! S; Q5 f' a+ d3 v（图片由Dr. E. Ghedin提供）* @6 Y2 ~/ V! i. K- y

0 X/ [, `( C$ y+ I5 K) R8 s: I% \CellVue® Claret和DAPI双重标记U937细胞。对数增长的U937细胞被标记上CellVue Claret后在37°C培养24小时。37°C孵育过程中的膜转运使内膜和质膜都进行了标记，但与CFSE不同，CellVue Claret标记不渗透核被膜。" y* o8 r/ q1 D7 ^

$ A6 {* K1 Q" @* q7 XLuminiCell Tracker™荧光纳米粒子' |* t, T/ _+ {) o  j) i
技术原理
1 K$ Z9 f6 \' S( C% SLuminiCell Tracker™荧光纳米粒子与传统的染料不同，不存在浓度或聚合引起的淬灭(ACQ)，- M* g3 O" E" h% {3 q
可用于在体内和体外进行增强效果的肿瘤和干细胞长期观察和追踪。
) s2 ~9 H: K5 a' W% V( d6 p4 CLuminiCell Tracker™具有新型染料AIE(aggregation-induced emission)特性的优势。新型AIE细胞追踪染料被封装在细胞可渗透的生物兼容应该纳米粒子内（AIE Dot），可提供超量的荧光（10x）、增强的光稳定性(3x)和低细胞毒性，适用于较长时间的生物成像应用。+ {8 n  S! @- h/ G7 @" }0 P
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技术特点：
9 g" d* G6 S1 e: g' w+ v' }• 荧光更强：是其他细胞标记技术的10倍2 ~' _' y" T2 e# x
• 光稳定性：荧光信号不淬灭的时间延长3倍2 N. f1 v# y# x, g1 m2 _- C, R
• 生物兼容：无毒性有机纳米粒子适合生物学应用
8 L( r6 [& I, a' G& m) W% u! H• 快速标记：4小时内轻松完成细胞标记
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LuminiCell Tracker™荧光纳米粒子的物理特性。A 装配LuminiCell Tracker™纳米粒子包括：附着细胞渗透TAT序列的荧光TPETPAFN AIE分子封装入DSPE-PEG200外壳内：1)自组装, 2)生物偶联。B. LuminiCell Tracker™纳米粒子和商业化Qtracker®的物理稳定性比较（37°C , 1xPBS中孵育0-9天）
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5 E% e$ ^' z( {) }* {; v应用举例：% D3 V" J1 Q4 c* d7 Y! Z" N- u% L& z

7 W: c8 u, G  i1 r" K; R使用LuminiCell Tracker进行体外肿瘤细胞追踪。HeLa细胞与4nM LuminiCell Tracker™-540孵育4小时弃掉孵育溶液，细胞再培养几天检测检测。LuminiCell Tracker™-540具有非常高的标记效率，D1标记将近100%，D5依然维持90%以上。D10依然可以观察到来自标记细胞的明显荧光。/ _/ h1 |9 _9 k7 G1 o# {, J. [) d. ^
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荧光成像探针5 w3 b+ s* c# m. v
特异细胞探针可识别细胞内不同的分析物，标记不同的荧光基团，可根据各基团的光谱特性进行分析，适合多种基于细胞的实验应用。
& Z5 K( `) @% b' Z8 |% [  p" SBioTracker活细胞染料
) L3 _8 }3 g( N3 _+ @Biotracker活细胞染料是一系列靶向细胞内不同分析物的特异荧光探针，不同的探针和荧光标记适用于不同的细胞实验。& m& s* u$ }" g( R; o

. Q. H8 o4 l# L3 H; TLYSO-TP在HeLa细胞中的细胞内定位
  j& S7 f0 }$ a! G7 b荧光生物传感器
% p" S0 ?  T0 C9 e- C生物传感器可用于检测特定蛋白质以及活细胞内蛋白质的亚细胞位置。荧光标记如GFP和RFP是一个有效的通过荧光显微镜或延时视频捕捉可视化细胞内感兴趣蛋白的方法。可视化活细胞可以实时显示细胞环境的改变。
6 I# F* \/ l" [8 [1 n慢病毒载体系统是一个受欢迎的引入基因和基因产物进入细胞的工具，与非病毒方法(如基于化学物质的转染)相比，慢病毒载体细胞的优势包括分裂和非分裂细胞的更高转染效率、转基因的稳定表达和低低免疫原性。
! S' Z+ \( T2 z6 ]9 l$ JLentiBrite™ Fluorescent Biosensors
$ m7 [  }) c% b: v1 J# VLentiBrite™荧光慢病毒生物传感器是一套新的预包装慢病毒粒子，编码自噬、凋亡、和细胞结构的重要和基本蛋白质，使不同细胞/病情状态的活细胞和体内分析可视化。3 w% U6 D$ R- m5 [% H
特点和优势：1 @: _* i1 b8 b& c1 Z! Y0 C3 @& ]
• 预包装，即用型、具有单体GFP&RFP荧光标签' f! \/ r4 o8 K* j) ]2 r; _9 z
• 每管最低浓度测定(≥3 x 108 IFU/mL)( D. y' T+ K7 v1 `1 l
• 与传统基于化学和其他基于非病毒的方法相比，具有更高的转染效率1 K3 p8 i0 z3 V/ C1 s
• 可转染分化、未分化和难转染细胞类型，比如原代细胞或干细胞. i0 f; e. U, {% a- f0 n9 W9 p4 h
• 不干扰细胞功能/ L+ f1 v  o) w9 Q* E6 I' b
• 经过荧光显微镜和活细胞分析验证& C+ u4 [2 N( ^5 {0 ?
应用举例：
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质粒和慢病毒转染易转和难转细胞类型的结果比较。使用质粒DNA和脂质体化学转染试剂或LentiBrite™慢病毒粒子将TagGFP2-tubulin编码结构转染HeLa细胞和HUVECs。
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; i! F& o$ W! n& B慢病毒转染细胞中β-actin的活细胞延时成像。TagRFP-β-actin慢病毒传感器转染REF-52细胞，使用油浸宽视野显微镜实时成像。2μM细胞松弛素D处理细胞后立即成像，静帧捕获显示了精细丝状组织向细胞核附近的粒状结构的转变，以及细胞外围的弥散分布。5 A( ]6 s8 j7 k" J% A" C
活细胞成像培养基# I$ M6 S: U4 N' |/ p, d  E& n& H* u
活细胞相关的实验操作如荧光显微镜、光遗传学和FACS等通常需要高水平或持续的暴露在蓝色光下，使有些培养基组分或添加剂会转化成有毒的自由基，尤其是DMEM、Neurobasal培养基、B-27、SATO和NS21等，从而导致细胞行为的显著变化和增加细胞死亡。有些培养基中甚至含有大量的荧光物质，会严重降低信噪比。7 L& |0 q' R8 `3 H0 s; K
BrightCell™ 光稳定细胞培养基
0 |- a! h4 P2 y3 n8 U& G默克新推出的BrightCell系列光稳定培养基系统通过去除或替换光毒性组分可以延长细胞暴露在蓝色光下的时间，维持较高的细胞活性和功能性。另外，该系列培养基具有极低的自发荧光和或光漂白，可大幅度提高使用荧光活细胞成像获得的数据质量。) a& J3 R, w; w  d
• BrightCell™ MEMO®光稳定培养基可在蓝色光照射之前或过程中替代DMEM9 ]7 i/ q5 t) g  @
• BrightCell™ NEUMO®光稳定培养基专为神经细胞培养开发，可在活细胞成像实验中替代Neurobasal®培养基
& u, e. |- T* h* B( g• BrightCell™ SOS®神经培养补充物可在活细胞成像实验中直接替代无血清光毒性替代物如B-27、NS21、SATO和N2等5 u& V# H( _$ c! ^
应用举例：1 J. |! R( h, p  s# N5 e
1 p' H( C+ M- K' H) G
少突胶质前体细胞OPCs(A,B)、皮质神经元(C)和海马神经元(D)的增强的活细胞荧光成像。分别使用BrightCell™光稳定培养基(MEMO/SOS和NEUMO/SOS)和标准培养基(DMEM/SATO和Neurobasal/B27)培养这些细胞，然后进行呈现。结果表明与传统培养基相比，使用光稳定培养基培养的NG2+ OPCs、皮质神经元和海马神经元延长蓝光暴露时细胞活力较高。& P# E0 k. w1 D1 _

, G0 \. |$ P$ x& j! P4 x胶质细胞的荧光细胞分选。与Neurobasal® 和 B27®相比，只有使用BrightCell™光稳定培养基NEUMO和SOS将MBP+ GFP/RFP标记的少突胶质前体细胞(OPCs)成功的进行FACs分选、培养和从成年小鼠大脑中分化。