成年鼠骨髓单个核细胞在体外培养中分化为平滑肌祖细胞 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 11:51 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：张坡，黄岚，宋明宝，赵晓辉，崔斌，周音频，尹阳光，朱光旭作者单位：基金项目：国家自然科学基金资助项目（No,30470729)　第三军医大学新桥医院全军心血管研究所，重庆 400037 . v, M. o1 G- Q




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      【摘要】  　　目的：探讨大鼠骨髓单个核细胞在体外经条件培养基诱导定向分化成平滑肌祖细胞的可行性。方法：分离4～6周龄的大鼠胫骨、股骨，以4℃预冷的DMEM培养基冲出骨髓，密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，在血小板源生长因子-BB （ PDGF-BB）和碱性成纤维细胞生长因子（ b-FGF）作用下，培养8～12d形成贴壁的梭形细胞。采用CD34与α-SMA免疫荧光染色进行鉴定，RT-PCR法测定其α-SMA mRNA表达情况。结果：在PDGF-BB作用下，82%的骨髓单个核细胞α-SMA染色阳性，78%细胞CD34染色阳性，新鲜分离的骨髓单个核细胞不表达α-SMA mRNA，体外培养后表达α-SMA mRNA。结论：体外培养的骨髓单个核细胞能分化为平滑肌祖细胞，可作为研究平滑肌细胞分化和筛选抑制再狭窄药物的工具。 5 i) n5 w, Q4 y5 Y' g' }
      【关键词】骨髓细胞；干细胞；肌细胞，平滑肌0 R, N' w2 t! J  D8 R, P
   　　Bone marrow mononuclear cells of adult rat to differentiate into smooth muscle progenitor cells in vitro/ZHANG Po, HUNAG Lan, SONG Ming|bao, ZHAO Xiao|Hui，CUI Bin, ZHOU Yin|pin, YIN Yang|guang, ZHU Guang|xu//Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2007，16（2）：128

Abstract：Objective:To explore the potential of rat bone marrow mononuclear cells (MNCs) to differentiate into vascular smooth muscle progenitor cells.Methods:After the tibias and femurs were dissected from 4~6 week|old rats, the marrow was flushed out with ice|cold DMEM mediumThe MNCs were obtained with density gradient centrifugation and cultured in DMEM medium containing 20鸖, 50ng/ml Platelet|derived growth factor-BB(PDGF-BB), 10ng/ml basic fibroblast growth factor(b-FDF).The cultured cells in vitro were identified with smooth muscle cell|specific α actin (α-SMA) and CD34 by immunofluorescent techniqueRT-PCR technique was used to identify the α-SMA mRNA level in fresh isolated marrow mononuclear cells and SPCs.Results:Smooth muscle|like cells outgrew from the culture of MNCs in presence of PDGF-BB and b-FGF.These cells were positive stain for α-SMA and CD34 on immunofluorescenceα-SMA mRNA was not expressed in fresh isolated MNCs but in the cells cultured for 8-12 days.Conclusion:Vascular smooth muscle cells can outgrow from bone MNCsThis model may be useful in study of smooth muscle cell differentiation and the origin of neo|intimal cells after vascular injury.& ?7 Y& n9 Z( s0 B; N1 [9 `
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Author′s　address：Cardiovascular Research Institute of PLA, Xinqiao Hospital of the Military Medical University, Chongqing 400037, China$ c$ g3 i  ]2 q0 O

Key words：Bone marrow cells; Stem cell;

Muscle cell,smooth muscle 成年机体外周血中存在一种CD34阳性，血小板源生长因子-BB（Platelet|derived growth factor, PDGF-BB）受体阳性，与造血干细胞具有多种相同表面抗原的细胞群，在体外培养能够增殖，并逐步分化成为平滑肌细胞，在体内可被血管损伤动员，参与损伤血管修复和病理性新内膜的生成，因此这种细胞被认为是循环平滑肌祖细胞（smooth muscle progenitor cells, SPCs）[1, 2]。正常动物外周血中SPC含量很低［3］，分离培养困难。骨髓作为外周造血干细胞的产生组织，其中是否存在SPCs，在体外是否可以分化成平滑肌细胞，目前尚不清楚，本研究旨在为研究平滑肌细胞分化调控和血管损伤后新生内膜增生发病机制提供新的实验佐证。9 n/ w, D) m: R$ x/ h

1 材料与方法

11 实验材料DMEM培养基购自GIBCO公司，优质胎牛血清购自PAA公司，淋巴细胞分离液购自TBD公司，胰酶、纤维连接素、PDGF-BB等购自Sigma公司。) K+ o- K# _. |2 R# m# K; V0 l
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12 实验动物Wistar大鼠，5~6周龄，雌雄不拘（第三军医大学实验动物中心提供）。

13 实验方法) }9 {8 |0 o' u' M# |* {! u

131 平滑肌祖细胞培养：将大鼠脱臼处死后置于75%酒精浸泡约4 min，无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨。用4℃预冷的无血清培养基冲出骨髓，吸管轻柔吹打，制成单细胞悬液。按等体积比在试管中加入淋巴细胞分离液，将单细胞悬液缓慢加在分离液上，4℃，500g离心30 min，取中间的单个核细胞层，用无血清培养基清洗2次，用DMEM培养基（含PDGF-BB 50 ng/ml，青、链霉素各100 U/ml，胎牛血清20%）调整细胞密度，以2106/cm2的密度接种于纤维连接素包被的培养板中，置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。4 d后更换培养基，去除非贴壁细胞，以后每3 d换液1次。7~10 d细胞生长融合，选取生长良好的细胞进行下列实验。
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132 免疫组化鉴定：将细胞培养在清洁灭菌的盖玻片上，细胞融合前用4 %多聚甲醛固定15 min，PBS 洗3 次，03%TritonX-100固定通透20 min，经PBS 缓冲液洗涤3 次后，用5 %山羊血清封闭30 min。加第一抗体4℃冰箱过夜，随后用PBS 缓冲液洗涤3 次，每次5 min，加入荧光标记第二抗体孵育30 min，经PBS洗涤后甘油封片，荧光显微镜观察，计算100个细胞中阳性细胞的百分比。
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133 RT-PCR分析：用Tripure提取细胞总RNA，根据大鼠平滑肌细胞特殊的α肌纤蛋白（α-SMA） cDNA 全长序列( Genebank X06801) 用Primer 50 软件设计上、下游引物，sense：5′CCCTGAAGTATCCGATAGAACACG 3′，anti sense：5′CCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT 3′，目的片段长度为277 bp。内参照采用β-actin，引物序列为：sense：5′ CTGCCGCATCCTCTTCCTC 3′，anti sense： 5′ CTCCTGCTTGCTGATCCATAT 3′，目的产物长度为398 bp。引物由上海基康公司合成。RT-PCR 反应程序：42 ℃逆转录3 h，94 ℃变性5 min，共30 个循环进行扩增反应。循环参数：94 ℃变性30 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，末次循环后72 ℃延伸10 min。取RT-PCR 扩增产物10μl 进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，照相。% l, l- p7 n, W1 ?4 M5 `

2 结果$ `$ N$ P9 p% t
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21 原代培养过程在接种24 h后，部分贴壁细胞呈梭形，可见数个细胞组成的小集落形成，1 周后集落迅速增多，并且逐渐长大融合成片，大部分细胞为梭形，部分细胞为三角形，其间少量圆形细胞，随传代转化为梭形（图1，见封三）。传代培养的细胞不再呈集落方式生长，而是呈均匀分布生长，细胞形态基本不变。/ P+ p: V* T. F+ v

22 培养细胞的分化鉴定在PDGF-BB作用下，培养细胞免疫荧光染色平滑肌细胞特异标志蛋白α-SMA阳性（图2，见封三），阳性率约为82%。无PDGF-BB情况下则无α-SMA表达。新鲜分离的骨髓单个核细胞不表达α-SMA mRNA，培养10天的细胞表达α-SMA mRNA（图3，见封三）。

23 培养细胞表达CD34造血干细胞标志：培养细胞免疫荧光染色CD34表面蛋白阳性，阳性率约为78%（图4，见封三）。
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3 讨论( Q4 u* ^* ]' X1 `8 g1 y- e
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　血管中膜平滑肌细胞迁移、过度增殖、合成大量胞外基质是动脉粥样硬化的重要病理生理基础。病理学检查发现粥样病损中的平滑肌细胞存在明显异质性，提示除中膜平滑肌细胞迁移外，可能存在其它来源的平滑肌细胞参与损伤血管的重构。Saiura等[4]研究移植物血管病时发现，移植物血管病变处大部分SMC来源于受体鼠，而非预想的来自于供体心脏本身，定量分析发现，病损处825%的细胞是受体来源的[5]。Sata等[5]发现高脂血症诱发的动脉粥样硬化动物模型中，新生内膜中约425%的平滑肌细胞是骨髓来源的，而且这些骨髓来源细胞是合成型平滑肌细胞。这些发现均提示骨髓源细胞参与了损伤血管修复和病理性新内膜形成。了解骨髓源SPC动员、损伤区归巢、分化、增殖等生物学行为，有助于加深我们对血管损伤后新内膜形成的认识，为再狭窄的防治提供新的思路。Fukuda等[1]研究发现人外周血单个核细胞在PBGF-BB作用下可分化为平滑肌祖细胞。我们在研究中发现，在PBGF-BB作用下，骨髓单个核细胞在体外也可分化为血管平滑肌细胞，这些细胞为梭形，免疫荧光染色证实骨髓源平滑肌细胞表达α-SMA，RT-PCR分析显示细胞表达α-SMA mRNA。正常情况下，动物外周血中SPC含量很低[3]，在严重血管损伤或G-CSF动员剂作用下，骨髓中SPC被动员入外周血，参与病理性新生内膜生成。利用未动员外周血分离培养SPC较为困难。骨髓是许多干祖细胞贮藏库，正常情况下，多种干细胞含量均较外周血高。我们采用骨髓细胞分离培养SPC获得成功。中膜平滑肌细胞在胚胎起源复杂，其分化受多种细胞因子调控[6]。近来研究发现，在PDGF-BB作用下，胚胎干细胞来源的血管祖细胞可分化为平滑肌细胞，而PDGF-CC无此作用[7]。韩雅玲等[8]研究发现，平滑肌细胞条件培养基也可诱导骨髓单个核细胞分化为平滑肌细胞，作者认为微环境依赖的定向分化是细胞分化的重要机制。我们发现，在PDGF-BB作用下，骨髓单个核细胞可分化为血管平滑肌细胞。Simper等[7]研究发现人外周血单个核细胞在PDGF-BB作用下可分化为平滑肌细胞。PDGF-BB是刺激血管平滑肌细胞增殖的重要有丝分裂原，在血管损伤局部和粥样病损处表达上调，其分布与过度增生的平滑肌一致。我们以往研究发现，骨髓单个核细胞在VEGF作用下，可分化为有功能的血管内皮细胞，能够参与缺血区新血管生成[9]。结合Simper的研究和当前研究结果，提示在血管损伤局部，PDGF-BB与骨髓细胞相互作用，促进新内膜形成，说明骨髓中不仅存在内皮祖细胞也存在平滑肌祖细胞。关于骨髓源平滑肌细胞起源，目前仍无定论。韩雅玲等[8]认为骨髓源平滑肌细胞起源于骨髓间质细胞。CD34是造血干细胞的重要标志，正常血管平滑肌不表达CD34标志蛋白。我们发现当前实验条件下分离的平滑肌细胞78%以上表达CD34造血干细胞标志。一种可能的解释是CD34 细胞是高度异质的，包含有更原始的间质细胞和血管祖细胞。已有研究显示高脂血症诱发的动脉粥样硬化新生内膜中大量平滑肌细胞CD34染色阳性[10]。PCI后冠状动脉CD34阳性细胞数量与再狭窄发生正相关[11]。骨髓CD34阳性细胞在血管损伤修复中的确切作用需今后实验证实。( h* E  T# k' O- z8 M
      【参考文献】
　　[1]Fukuda D, Sata M, Tanaka K, et al.Potent inhibitory effect of sirolimus on circulating vascular progenitor cells[J]Circulation, 2005,111(7):926-931.

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